動物園梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及耐藥性

王煒強 孫浩云 楊志松*

(1.西華師范大學生命科學學院，南充，637000；2.山東新華醫療器械股份有限公司，淄博，255000)

梅花鹿(Cervusnippon)是鹿科(Cervidae)鹿屬動物，具有14個亞種，是亞洲東部的特產種類之一，也分布于俄羅斯東部、日本和朝鮮，曾廣布中國各地，現僅殘存于吉林、內蒙古中部、安徽南部、江西北部、浙江西部、四川、廣西等幾個有限的區域內，因其夏毛棕黃色、遍布鮮明的白色梅花斑點，故稱“梅花鹿”[1-4]。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)屬于條件致病菌，該菌主要包括3個亞種，主要存在于動物及人的消化道、呼吸道、泌尿生殖道等，可引起禽類、哺乳動物、魚類等多種動物發病，為臨床中重要的人畜共患病之一[5-7]。近年來，關于野生動物感染肺炎克雷伯氏菌的報道逐漸增多，已從多種患病的動物體內分離得到高致病性、高耐藥性肺炎克雷伯氏菌[8-9]。肺炎克雷伯氏菌主要引起梅花鹿的敗血性肺炎，2009年首次被報道。梅花鹿感染肺炎克雷伯氏菌后主要表現為咳嗽、呼吸困難、逐漸消瘦，嚴重的可引起死亡，剖檢可見肺臟淤血、出血、水腫等，肝臟表面有小白色的壞死點[10-11]。肺炎克雷伯氏菌的治療臨床中主要以抗生素防治為主，由于不合理使用導致多重耐藥菌株不斷出現，不僅為養殖業造成嚴重的經濟損失，同時威脅公共衛生安全[12]。本研究采集動物園患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織76份，進行肺炎克雷伯氏菌分離鑒定，對其致病性和耐藥性檢測，旨在為梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌防控及臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

2018—2020年，從南充西山動物園采集患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織76份。

1.1.2 主要試劑

普通營養肉湯、普通營養瓊脂平板、肺炎克雷伯氏菌鑒別培養基——麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂(MIAC)，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；Raid ID 32 E陰性菌鑒定試條購自bio-Merieuxsa公司；藥敏紙片購自廣東環凱生物有限公司；DL2000 marker，2×TaqMarker Mix，均購北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 試驗動物

25 g左右昆明系小鼠，由華中農業大學動物醫學院動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養

將采集的患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織處理后，直接接種于MIAC平板，37 ℃培養12～18 h，挑MIAC平板的單個菌落接種于營養肉湯中進行純化培養后，進行形態學觀察和生化試驗鑒定。

1.2.2 生化試驗

將分離菌株純化培養的菌液濃度調整為0.5個麥氏濁度，按照Raid ID 32 E腸桿科陰性菌鑒定試條說明書對分離菌株進行生化鑒定。

1.2.3 細菌的PCR鑒定

按照韓坤[6]的方法，設計肺炎克雷伯氏菌保守區16S rRNA引物：P1，5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′；P2，5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′。該引物由華大基因合成。用水煮法提取分離菌株的DNA，用16S rRNA引物對疑似肺炎克雷伯氏菌的分離菌株進行PCR檢測，PCR產物送上海生工進行基因測序，其測序結果采用 NCBI-BLAST比對，同源性≥99.0%，可以定義到種的水平；若同源性在97.0%～98.9%，可以定義到屬的水平；若同源性<97.0%，則定義為科水平，鑒定標準按照同源性≥97.0%判定。

1.2.4 致病試驗

按照張文舉等[13]的方法，對培養至對數期的分離菌株進行計數，每株分離菌株采取腹腔注射方式注射5只小白鼠，劑量為0.25 mL(108cfu/mL)，對照組注射等量無菌的生理鹽水，攻毒12 h后，試驗期為6 d，試驗期間觀察小白鼠發病情況，并進行細菌分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗

參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2019推薦的標準K-B紙片法進行試驗，以及結果判斷、統計結果并分析分離菌株的耐藥性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養

疑似肺炎克雷伯氏菌分離菌株在鑒別培養基MIAC上長出了邊緣整齊、大小一致、半透明的桃紅色菌落。革蘭染色鏡檢觀察到，分離菌株為陰性的兩端鈍圓的粗短桿菌狀，與《伯杰氏細菌鑒定手冊》報道的肺炎克雷伯氏菌的培養特性與形態學基本一致。

2.2 細菌生化鑒定

由表1可見，梅花鹿源肺炎分離菌株初步被鑒定為肺炎克雷伯氏菌，符合率在95%以上。

表1 梅花鹿源肺炎分離菌株的生化檢測結果

2.3 細菌的PCR鑒定

對初步鑒定為肺炎克雷伯氏菌的52株分離菌株，用16S rRNA引物進行PCR鑒定。結果顯示，52株肺炎克雷伯菌分離株均擴增出大約為1 500 bp的目的條帶(圖1)。測序結果顯示，從患病梅花鹿體內分離的52株肺炎克雷伯氏菌與GenBank中登錄的12株肺炎克雷伯氏菌參考菌株的同源性為97.0%～99.0%，從而在分子生物學水平證實了從患病梅花鹿體內分離的菌株為肺炎克雷伯氏菌。

圖1 分離菌株PCR鑒定結果

2.4 致病性檢測

試驗組攻毒的小白鼠在攻毒后2～6 d出現不同程度的發病癥狀，主要表現為采食量減少、精神沉郁、呼吸困難、慢慢出現死亡，個別的小鼠出現急性死亡。剖檢死亡的小白鼠，采集肺部、肝臟中分離得到的肺炎克雷伯菌，對照組的小鼠健康存活。經統計，40株肺炎克雷伯氏菌對小白鼠具有不同程度的致病性。

2.5 耐藥性分析

用K-B藥敏紙片法檢測致病性肺炎克雷伯氏菌耐藥性，由其耐藥性(表2)可知，40株致病性肺炎克雷伯氏菌對阿莫西林、氨芐西林、恩諾沙星、慶大霉素、新霉素、多西環素、大觀霉素、林可霉素、磺胺二甲氧嘧啶9種藥物耐藥性較高，耐藥率在70.0%～100.0%，對頭孢噻呋、頭孢喹肟、環丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考5種藥物耐藥率較低，耐藥率在7.5%～27.5%。這表明，分離的40株致病性肺炎克雷伯菌對臨床中常用抗生素產生了不同的耐藥性。

表2 分離菌株的耐藥性結果

3 討論

肺炎克雷伯氏菌可以引起多種動物和人發病，該菌主要存在不同宿主的呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，并引起感染，該菌也是人外科手術中常見的耐藥性菌之一，對人的危害也很大，是臨床中重要的人畜共患病之一[7-8]。在正常情況下，肺炎克雷伯氏菌不會引起動物發病，但當外界環境條件改變，出現冷熱交替、換料及運輸等因素導致其機體抵抗力低下時，該菌在宿主的體內大量繁殖并致病，發生內源性感染，其感染率和病死率均較高[14-15]。

相關研究表明，水貂(Neovisonvison)、狐貍(Vulpexlagopus)、梅花鹿等多種動物感染肺炎克雷伯菌后，主要臨床表現為咳嗽、呼吸困難，急性感染可以造成鼻孔、嘴角出血，嚴重可以導致其死亡，同時還可以繼發大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)或巴氏桿菌(Pasteurella)等多種病原感染，呈現混合感染的狀態，對動物的危害較大，尤其對水貂、狐貍、貉(Nyctereutesprocyonoides)等動物養殖造成嚴重的經濟損失[6-11]。本試驗從76份采集自動物園患有呼吸困難的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺臟、心血、肝臟等病料組織中分離得到了40株致病性肺炎克雷伯菌，證明該菌是引起梅花鹿肺炎的主要病原菌，其可能存在潛在威脅，應該引起重視，并注意做好防控。

肺炎克雷伯氏菌對臨床中常用的抗生素藥物產生很強的耐藥性，個別的分離菌株對β-內酰胺類及碳青霉烯類抗生素也產生耐藥性，給治療帶來了很大的困難，應該引起重視[12-15]。國內對狐貍、水貂、豬、牛等動物源肺炎克雷伯氏菌的耐藥性報道比較多，關于梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的耐藥性報道較少。本研究表明，分離的40株致病性肺炎克雷伯菌對阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素等9種藥物耐藥率在70.0%以上，對其他藥物的耐藥率在7.5%～27.5%。說明從動物園梅花鹿體內分離的肺炎克雷伯氏菌耐藥性嚴重。當發生本病時，應該合理用藥，提高治療效果。由于該菌是通過呼吸道進入肺部，引起肺部實變和肺炎，在防治過程中應進行環境消毒，綜合防控，減少該病的發生與流行。