ISSR和SRAP標記技術在葫蘆科植物種質資源研究中的應用

蹇黎

（貴州畢節學院地理與生命科學院，551700）

葫蘆科（Cucurbitaceae）植物一般是常見雙子葉瓜類爬藤植物的總稱，是食用植物中最重要科之一，僅次于禾本科、豆科和茄科。中國具有豐富的栽培葫蘆科植物種質資源，幾乎遍及全國各地，共有29余屬，142余種，占葫蘆科植物的1/4[1]。葫蘆科植物不僅具有食用價值，而且還具有很高的藥用價值和經濟價值。但由于葫蘆科植物具有特殊的生長環境和生活習性，如果只靠單一的常規育種手段對其進行品種改良，可能會導致種質資源的匱乏而致使資源的保護利用、研究與推廣受阻，從而不能滿足市場的需求，因此，解決這些問題必須借助于先進的研究技術與方法。

分子標記是繼形態學標記、生物化學標記以及細胞學標記之后發展起來的一種直接反映遺傳物質DNA水平多態性的遺傳標記，具有基因組變異豐富、標記數量多、目標基因表達不受生物的發育階段及環境影響、檢測手段方便快捷、成本較低等特點，已成為資源系統鑒定與種質資源育種研究最高效的手段之一。ISSR（Inter-simple sequence repeat，簡單重復序列間擴增）和SRAP（相關序列擴增多態性，Sequence-related amplified polymorphism）都是基于PCR標記系統的一種新型的顯性分子標記技術。ISSR是在微衛星基礎上發展起來的[2]，結合了簡單重復序列（Single sequence repeat,SSR）標記技術和隨機引物擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）標記技術的優點，其引物不但能在種間通用，而且更能揭示物種間的多態性，其檢測手段非常方便快捷。SRAP綜合了RAPD和AFLP的高效、重復性好、便于目標基因的克隆與測序等諸多優點[3]。ISSR和SRAP標記技術現已廣泛應用于葫蘆科植物種質資源的親緣關系鑒定與遺傳多樣性分析、分子遺傳圖譜的構建與目的性狀基因的標記定位、基因庫的構建和基因克隆以及育種輔助選擇與品種的純度鑒定等方面的研究。本文將從以上幾方面來綜述ISSR與SRAP分子標記技術在葫蘆科植物種質資源研究中的應用現狀，并對其資源更合理高效的保護和利用進行探討。

1 ISSR與SRAP原理及特點

ISSR與SRAP分子標記技術是檢測種質資源間（內）的基因片段差異性最高效、最理想的遺傳標記方法。

1.1 ISSR分子標記

ISSR分子標記是在微衛星基礎上發展起來的一種顯性遺傳標記，結合了SSR和RAPD標記的優點，是在不用知道SSR兩端的堿基序列的基礎上添加2～4個隨機核苷酸。在PCR反應過程中，此引物既保證了錨釘序列位點的退火溫度，也可以減少其他靶點的退火幾率，對基因組片段的差異進行檢測，其擴增產物經過電泳分析進行多態性分析。ISSR標記技術具有其引物可在種間通用、穩定性好、多態性高、無需知道SSR靶標序列信息、重復性好、易操作、快捷方便、成本低等諸多優點。不足之處在于不同引物及不同材料間PCR擴增反應最佳條件可能不盡相同，很難區分顯性純雜合基因型。目前，許多葫蘆科植物均建立和優化了各自最適的ISSR-PCR反應體系。

1.2 SRAP分子標記

SRAP分子標記是一種結合了RAPD、AFLP、RFLP等分子標記優點并克服其缺點的PCR標記系統的顯性新型標記，是通過獨特的雙引物（17 bp上游引物和18 bp下游引物）設計對啟動子或內含子區域進行特異擴增，其引物具有通用性。該標記是建立在不同種質資源的啟動子、內含子與間隔區長度的不同而致使其種間和種內表現出明顯的多樣性。SRAP分子標記具有多態性高、重復性好、易操作、快捷方便、成本低、在基因組中分布均勻、易對特定序列進行測序與相關基因的克隆等諸多優點。

2 ISSR與SRAP技術的應用

ISSR與SRAP分子標記技術與其他分子技術及傳統的常規遺傳標記相比較而言，優點更多，已在葫蘆科植物種質資源的研究中廣泛應用。現將ISSR與SRAP分子標記技術在葫蘆科植物中的應用情況進行綜述和探討。

2.1 遺傳多樣性研究

植物遺傳多樣性一般是指種間或種內的不同個體的遺傳差異之和，是物種生存適應與發展進化的基本特征及物種長期進化演變的產物。研究物種的遺傳多樣性可以了解與其生長環境之間的關系，采取科學高效的措施保護瀕危物種遺傳資源基因，認識生物多樣性的起源與進化，同時也根據資源的DNA指紋圖譜和各個目標性狀間的多樣性，使其植物種質資源更能合理高效的利用。高山等[4]采用ISSR分子標記技術對38份瓠瓜種質進行遺傳多樣性分析，12個ISSR引物共擴增出96條多態性帶，平均每個引物擴增的多態性帶數為8條，多態性比率平均為83.5%。劉萬勃等[5]利用ISSR標記對甜瓜種質進行遺傳多樣性研究，10個ISSR引物共擴增出73條多態性帶紋，多態比率為65.51%。王佳等[6]利用ISSR對黃瓜種質資源進行遺傳多樣性分析，8個ISSR引物共擴增出42條帶紋，其多態比率為85.71%。段會軍等[7]利用RAPD、ISSR和AFLP對西瓜枯萎病菌進行遺傳多樣性評價，21個引物共擴增出188條帶紋，其中多態性帶134條，多態比率為71%。康建坂等[8]運用ISSR分子標記對48個苦瓜樣品的遺傳多樣性進行研究，14個ISSR引物共擴增出181條帶紋，其中多態性譜帶為113條，多態性比率為60.32%。張愛萍等[9]采用SRAP技術對西瓜種質資源的遺傳多樣性進行研究，51個引物組合共產生431條擴增帶，其中243條帶具有多態性，多態性比率為56.4%。陳蕓等[10]利用SRAP對甜瓜種質資源進行遺傳多樣性分析，16對SRAP引物組合擴增出452個位點，其中265個為多態性位點，多態性比率為58.63%。劉軍等[11]利用12對SRAP引物組合對絲瓜種質資源進行遺傳多樣性分析，共擴增出118條多態性帶紋。Sikdar等[12]利用同工酶、RAPD和ISSR標記對葫蘆科植物遺傳多樣性分析，10種ISSR引物共擴增出100條多態性帶紋。Heikal等[13]利用RAPD和ISSR技術對南瓜屬植物遺傳多樣性進行分析，7種ISSR引物酶共擴增出263條帶紋，其中多態帶紋為243條，多態性比率為92.4%。Ferriol等[14]利用SRAP和AFLP對西葫蘆進行了遺傳多樣性分析。

2.2 親緣關系及系統分類研究

ISSR和SRAP分子標記技術能有效地確定葫蘆科植物種質資源間的親緣關系及品種間的遺傳距離，進而可以劃分雜交種優勢群，提高葫蘆科植物育種效率。Heikal等[13]利用RAPD和ISSR技術對南瓜屬植物的親緣關系進行鑒定，C.moschata1、C.moschata2、C.pepo5、C.pepo7、C.pepo9 品種之間的親緣關系最近，而C.pepo1與C.pepo9、C.pepo 5與C.moschata5之間的遺傳相似系數最低，親緣關系最遠，ISSR技術將112個南瓜屬植物劃分為兩大類群。鐘開勤[15]利用RAPD和ISSR技術對38份瓠瓜種質資源進行親緣關系分析，其遺傳相似系數分布在0.43～0.96，福州芋瓠05與漢龍碧玉02相似系數最大，為0.96，ISSR將38份材料分為5個類群8組，主坐標分析將其分為4個類群10組。陳朝文[16]利用ISSR技術對絲瓜種質資源進行親緣關系分析，大部分地方絲瓜品種的遺傳相似系數為0.7以上，其中明春研三號絲瓜和純英早青肉絲瓜，早雜二號肉絲瓜和金美肉絲瓜，春研三號絲瓜和長沙肉絲瓜GS值都在0．93以上，親緣關系最近，此標記技術將162份黃瓜種質資源劃分為五大類群。汪偉裁[17]利用ISSR技術對苦瓜種質資源進行分析，武漢品種641和日本品種643相似系數達0.786，其親緣關系很近。高山等[18]利用ISSR技術對苦瓜種質資源遺傳多樣性進行分析，將38份苦瓜種質資源劃分為三大類群7組，劃分類群與形態上以顏色分類比較接近。

2.3 品種及種質資源鑒定

ISSR標記技術和SRAP技術能快速高效地對葫蘆科植物品種及種質資源進行鑒定。高山等利用ISSR技術對38份苦瓜種質資源進行分析，10個引物能擴增多態性帶紋（200～2 000 bp），其中UCB 835擴增產物多態性比率最高（66.67%），能將品種有效區分。羊杏平等[19]利用RAPD和ISSR標記鑒定了西瓜雜交種的遺傳純度，62個ISSR引物中發現了2個能產生母本特異標記條帶的引物（JAASIS27和JAASIS57），分別產生了母本特異標記，檢測雜交種蘇蜜5號的遺傳純度。王吉明等[20]利用SRAP技術鑒定了甜瓜屬植物種間雜交及其雜交后代，1對SRAP引物（E14/M2）擴增出少量父本（西印度瓜）特征帶，證明西印度瓜與V129甜瓜已經在DNA分子水平上發生了交換。王從彥等[21]利用SRAP技術鑒定了西瓜種子純度，32對SRAP引物對5份西瓜雜交種純度分別為 94.91%，94.18%，94.91%，94.91%，94.64%。王惠哲等[22]應用SRAP技術分析了28份黃瓜的遺傳差異，明確在不同的種間和種內存在著一定程度的遺傳分化。

2.4 遺傳圖譜的構建

通過構建葫蘆科植物種質資源的遺傳圖譜來顯示其特異基因或遺傳標記的相對位置，為系統研究葫蘆科植物資源基因組和特異基因的定位克隆提供理論依據。徐晴等[23]利用39個SRAP標記對黃瓜遠緣群體進行分子遺傳連鎖圖譜的構建和分析，該遺傳圖譜覆蓋基因組長度為743.11 cM，平均圖距4.67 cM，每個連鎖群上標記數3～41個，長度8.02～140.16 cM，最大的連鎖群含有最多的41個標記，覆蓋140.16 cM，平均間距3.42 cM，最小的連鎖群含有4個標記，覆蓋8.02 cM；平均圖間距最大的是第7連鎖群，為8.32 cM，最小的是第9連鎖群，為2.01 cM。易克等[24]利用38個SSR和10個ISSR引物構建西瓜遺傳圖譜，總長度為558.1 cM，平均圖距為11.9 cM，其中最大的連鎖群（s1）由24個標記組成，總長度為 305.7 cM；3 個較小的連鎖群（s3，s5，s6）中，標記數為 3～5 個，距離在 28.5～57.3 cM；其余均為2個標記組成的連鎖群，11個連鎖群中有5個連鎖群（s3，s4，s7，s9，s10）。 張仁兵等[25]利用 13 個 ISSR標記用重組自交系構建西瓜分子遺傳圖譜（15個連鎖群），包括1個最大的含31個標記的連鎖群（277.5 cM）、6 個大的含 4～12 個標記的連鎖群（51.7～172.2 cM）和8個小的含2～5個標記的連鎖群（7.9～46.4 cM），覆蓋基因組的 1 027.5 cM；2 個標記間的平均距離為11.54 cM。Yeoah等[26]利用SRAP和ISSR標記構建了黃瓜的遺傳圖譜，覆蓋基因組的992.2 cM。

3 結語

目前，雖然葫蘆科植物種質資源的保護和育種技術在不斷的發展，新的葫蘆科植物品種也在不斷的育成，但這仍不能滿足國內外蔬菜市場的需求。在葫蘆科植物種質資源研究方面，隨著分子標記技術的完善與發展，該技術能夠準確地鑒定、評價和發掘葫蘆科植物種質資源的優異特異性狀基因；加快葫蘆科植物品種的培育、葫蘆科植物特異基因的克隆、資源的遺傳多樣性及親緣關系的鑒定；能夠高效合理地利用和創新優質種質資源，改良其抗病、抗逆、延長成熟期等多種農藝性狀來豐富葫蘆科植物種質資源的遺傳基礎。綜上所述，ISSR和SRAP分子標記技術均具有操作簡便、重復性強、引物通用、多態性好及成本低等諸多優點，但只是應用到部分葫蘆科植物種質資源遺傳多樣性及親緣關系等方面的基礎研究。因此，只有將分子標記技術融入到育種中才能培育出觀賞和食用藥用價值高的優良新品種。

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