苜蓿抗寒性研究進展

王運濤，于林清，薩 仁

（中國農業科學院 草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010）

苜蓿（Medicago sativa）起源于小亞細亞、外高加索、伊朗和土庫曼高地，是一種優良的豆科牧草，素有“牧草之王”的美稱。苜蓿在農牧業生產中起著重要作用，是家畜的主要優良飼草，無論是青草還是干草，都具有品質優良、適口性好的特點。也是農作物的良好前茬，可以提高后茬作物的產量。苜蓿也是水土保持植物、蜜源植物，也可以作為蔬菜、食品利用［1］。正因為如此，苜蓿在世界范圍內具有廣泛的栽培面積，約有3 300萬hm2，其中，北美洲所占比重最大，歐洲次之，第3位是南美洲，相繼為亞洲，非洲，大洋洲最少。美國種植面積最大，超過1 000萬hm2，阿根廷為700多萬hm2。進入21世紀以來我國的栽培面積在一直維持在230～260萬hm2［2－5］。在我國北方高緯度、高海拔地區，由于低溫、干旱等原因造成苜蓿的越冬率低，且容易發生凍害和死亡現象，從而造成苜蓿的大面積減產。低溫已經成為限制我國北方苜蓿產業發展的重要環境因素。苜蓿的越冬問題也已經成為制約我國北方苜蓿草地成功建植和草地可持續利用的關鍵問題［6］。因此，研究苜蓿的抗寒性具有重要的理論和實際意義。

1 苜蓿的形態結構與抗寒性關系

1.1 莖葉的形態結構與抗寒性的關系

莖和葉作為植物暴露在環境中的組織或器官最易受到并反映環境諸因子變化所帶來的影響。目前，有關苜蓿莖葉形態結構對低溫適應性的報道較少。劉香萍等［7］研究發現，葉節長度與抗寒性之間相關性不大，但第一真葉葉腋枝條長度卻與抗寒性呈顯著正相關，可作為評價苜蓿抗寒性能的參考指標［7］。孫啟忠等［8］研究表明，播種當年分枝數的多少、株高及單株重量在不同播期間差異顯著，播種期越早則分枝增多、株高及單株重提高，苜蓿越冬率也相應增加。崔國文等［9］研究結果報道，苜蓿的越冬率與葉片寬長比呈顯著負相關，葉片相對窄的品種，其越冬能力強，抗寒性較好，反之則差。同時氣孔密度大，葉片組織緊密度大、疏松度小，葉脈凸起度大的苜蓿抗寒性較強。

1.2 根系類型與抗寒性

根系是植物吸收和貯存營養物質的重要器官，根系生長發育的狀況直接影響到地上部分的產量。苜蓿為軸根型植物，根系發達［10］。苜蓿的抗寒性在很大程度上取決于根系，其根系具有3種類型：直根型、根莖型、根蘗型。根莖型苜蓿可形成地下莖，可以自身更新，當主根枯死后，可與母株分離而保持獨立生存，因此比單個主根更能忍受凍害［11－13］。根蘗型苜蓿因具有大量側根（水平根）而具有較強的抗寒性。但國內一些地區引種觀察表明，根蘗型苜蓿并不表現出比直根型苜蓿更抗寒，根蘗型特性具有非常明顯的地域性，由此造成了抗寒性的差異［14］。因此，關于根系類型與抗寒性的關系還有待于進一步研究。

苜蓿的根頸與抗寒性關系密切。根頸是苜蓿根與莖的結合部位，也是地上部分和地下部位物質交換過程中，營養物質貯藏的樞紐部位，在苜蓿的生長過程中，根頸能形成大量的芽，從而形成地上部莖枝，也是越冬芽著生的部位。并且可以隨著生長年限的增加逐漸加粗和向土中深入。當溫度變化幅度大時，苜蓿根頸容易受到傷害。在冷熱交替變化中，根頸細胞間隙水分發生凍融交替變化，會引起根頸和根細胞受損。對受凍害后紫花苜蓿根頸再生方法的研究發現，通過除去凍害部位，可防止根系繼續腐爛，使根系與地面的距離變短或露出地面從而增加光照強度，可促使未受凍害的根系發芽［15］。根頸入土越深根頸越粗，越容易越冬。孫啟忠等［16］在苜蓿播種時不同覆土厚度的研究中發現覆土厚根頸入土深，根頸受凍害的可能減小，同時根頸的入土深度又促進了根頸生長膨大，增強了植株的耐寒性，從而提高了越冬率。史紀安等［17］通過對不同秋眠級別的紫花苜蓿品種根系發育能力的研究，結果表明根頸分枝能力強、增粗速度快，入冬前根頸粗壯入土較深，積累越冬營養物質多，有利于翌年萌發枝條和實現高產，同時根頸隨氣溫下降而向土壤中下移，提高冬季的抗寒能力。

2 低溫下苜蓿植株的生理生化的適應性變化

植物只有在生長過程中不斷的與環境進行物質和能量的交換才能維持其生命活動。外界環境條件的好壞直接決定著植株的生存狀況。尤其是不良環境，會引起植物體內一系列的生理生化變化，主要表現為對生長和發育的抑制，嚴重時會導致植株的死亡。

2.1 細胞膜透性與抗寒性

苜蓿的抗寒性與細胞膜透性有著密切的關系。在低溫脅迫下，苜蓿的細胞膜受損，膜透性增大。而抗寒性強的品種其細胞膜透性較抗寒性差的品種要小，電解質滲出率低［18，19］。鄧雪珂等［20］通過對苜蓿進行0～－7℃冷處理后測定了離體葉片的質膜電導率，結果表明，隨著溫度的降低，苜蓿葉片的電導率總體呈現增長趨勢。在0～－3℃時，與未經低溫脅迫相比呈緩慢增加，而在－3～－4℃之間時電導率明顯增加，表明葉片細胞的質膜通透性增大。由此可以看出，當超過－4℃時，苜蓿的葉片質膜就會受到嚴重的冰凍傷害，而對于－3℃的低溫就有較好的抵御能力［20］。

2.2 碳水化合物與抗寒性

當植物經受低溫脅迫時，植物組織的胞內糖含量會呈現增加的趨勢。研究認為糖可以經低溫代謝產生未知有效變化，或者通過滲透作用增加植株的抗性。有報道稱低溫下植株中可溶性糖的積累是作為滲透調節物質和防脫水劑而起作用，在低溫脅迫下，可以降低細胞水勢、增強持水力［21］。有報道苜蓿主根中非結構性碳水化合物（蔗糖、葡萄糖、總還原糖及總糖）的濃度抗寒性形成階段明顯增加但在春天苜蓿返青時下降［22］。陶雅等［23］通過對國內外6個紫花苜蓿品種在不同時間的根部可溶性糖含量的動態變化分析，結果表明，苜蓿根內的可溶性糖含量從9月中旬開始升高，11月中旬達到最高峰，之后開始逐漸下降，一直延續到次年5月中旬，說明可溶性糖是一種低溫保護物質，能夠提高苜蓿對低溫脅迫的適應。但也有研究認為，在冷適應階段糖積累并沒有隨品種抗寒性的不同而表現出明顯的趨勢性變化。越冬率低的Aurora苜蓿含糖量一直處于較高水平，這可能是這一品種存活植株對當地氣候條件適應性的反應［24］。因此，不能單純把糖分含量作為區別苜蓿抗寒性強弱的指標。有關可溶性糖與抗寒性的關系還有待于進一步研究。

2.3 脯氨酸與抗寒性

氮代謝是植株體內最基本的物質代謝之一，是植物正常生長發育的物質基礎。研究結果表明，氮直接關系到苜蓿的再生與返青，苜蓿再生及返青時所消耗的氮均來自根部。隨著氣溫逐漸變低，苜蓿根部氨基酸總量會顯著升高，并在冬季維持較高的水平，直到第2年早春返青時下降。游離脯氨酸作為細胞質的滲透調節物質在植物對抗低溫脅迫時起到平衡細胞代謝的作用，以保持細胞內環境的相對穩定［25］。有試驗結果表明，當受到低溫脅迫時，植株游離脯氨酸的含量開始上升，隨著低溫處理時間的延長，紫花苜蓿游離脯氨酸的含量有大幅度的增加，特別是在低溫脅迫12h后，增長十分明顯，說明游離脯氨酸在紫花苜蓿中作為一種植株耐寒性相關物質而存在，隨低溫脅迫的時間增加逐漸積累，在12h后相關積累機制大量激活，導致其含量急劇上升［20］。這證明了苜蓿對低溫的適應機制是通過提高胞內小分子物質的絕對含量來實現的；脯氨酸絕對含量的增加有利于提高苜蓿的抗寒性［26］。

2.4 脂肪酸與抗寒性

植物的細胞膜脂肪酸的不飽和程度越高，其相變溫度越低，抗寒性越強。在低溫鍛煉時苜蓿抗寒品種的脂類增多，其中，主要是亞油酸和亞麻酸含量增加以及膜組分磷脂的增加。苜蓿細胞膜脂肪酸的不飽和程度升高，類脂的相變溫度下降，這時細胞膜從正常的生理活動狀態液晶態轉變為結晶態，可在低溫下維持細胞膜的正常功能，因而苜蓿的抗寒能力增強［27］。夏明等［28］通過對20種苜蓿葉片膜脂脂肪酸組分和變化的分析，發現在5℃低溫狀態下，苜蓿品種間葉片膜脂棕櫚稀酸和亞麻酸含量高、變化率大，表現出對低溫環境的敏感，為苜蓿的抗寒指示性脂肪酸。

2.5 保護酶系統變化與抗寒性

在正常情況下，植物體內活性氧和自由基的產生和清除之間處于平衡狀態，而當植物受到低溫脅迫時，這種平衡就會受到破壞，植物細胞就會受到損傷。植物體內活性氧清除劑包括抗氧化酶和抗氧化劑。其中，抗氧化酶主要有：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）等。非酶性的抗氧化劑如壞血酸（ASA）、谷胱甘肽（GSH）和維生素E等［29］。SOD、POD是植物對膜脂過氧化的酶促防御系統中重要的保護酶，SOD在細胞保護酶系統中的作用是清除超氧自由基O2－，同時產生歧化產物H2O2。POD在保護酶系統中主要起到酶促降解H2O2的作用，從而使植物抵抗在逆境脅迫下代謝過程產生的有害物質對細胞的傷害，表現出一定的抗逆性［30］。在低溫脅迫初期，幼苗葉片SOD、POD活性上升，隨著脅迫時間的延長，在脅迫后期苜蓿幼苗葉片SOD、POD保護酶的活性下降后仍能維持較高水平的活性，這可能是SOD、POD保護酶的活性的耐寒機制已經形成，酶的活性維持在較高水平，能夠使活性氧代謝處于一定的平衡，避免了活性氧等各種自由基的大量積累，減輕了膜脂過氧化作用，降低了細胞膜的破壞程度，增強了對低溫的適應能力［23］。楊秀娟［31］在對抗寒性差異較大的2個苜蓿品種于不同時期進行取樣，然后測定根頸的POD，SOD和CAT酶活性，結果表明：從夏季到冬初，紫花苜蓿2個品種根頸中的POD，SOD和CAT酶活性均隨著季節溫度的降低而呈現先上升后下降的趨勢，在初冬是達到頂峰，進入冬季深秋眠間，3種酶活性均有一定的波動，且活性明顯下降。梁慧敏等［32］通過對秋末初冬和初春返青期同工酶的變化研究，結果表明，秋冬隨溫度的降低，苜蓿過氧化物酶同工酶譜帶和活性明顯增加，且根蘗型增加快于直根型苜蓿；而早春隨溫度的上升，苜蓿根系酶活性和酶帶數也呈波動式變化，與溫度呈明顯的負相關關系，其中，對溫度變化敏感的根蘗型苜蓿與直根型苜蓿相比，根酶活性始終保持較高水平，有利于及時清除細胞內的有毒物質，保護生物膜不受損害。魏臻武等［33］利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果表明，不同苜蓿品種具有6條共同的SOD同工酶酶帶，適應高寒地區氣候條件的當地材料同德雜種苜蓿表現出與其它苜蓿品種較大的特異性。

2.6 激素變化與抗寒性

隨著秋冬溫度的下降，植物的生長活力呈現下降趨勢，植株體內的激素發生明顯變化，主要表現為ABA大量增多，GA和IAA等促生長激素的減少。ABA既可以誘發與抗逆相關的新的蛋白質合成，增強抗逆性，也可以促進氣孔關閉，減少水分損失，維持體內水分平衡，減少逆境傷害。有許多試驗結果已經證實植物經低溫處理后內源ABA含量明顯增加，且抗寒性強的品種ABA含量高于抗寒性弱的品種［34］。對植物施加外源ABA激素會影響內源ABA激素的合成。王成章等［35］通過對不同秋眠類型苜蓿品種施加外源ABA的試驗結果表明，無論是秋眠型、半秋眠型或非秋眠型苜蓿，噴施外源ABA對苜蓿體內ABA的積累均有極顯著的促進作用；又由其株高增長變化看，高濃度外源ABA處理對苜蓿生長抑制更加明顯，但秋眠型苜蓿較半秋眠型和非秋眠型更易受外源ABA誘導而增加內源ABA的累積量。因此，若施用外源ABA改變苜蓿體內的平衡狀況來誘導基因的表達從而誘導秋眠反應，提高苜蓿抗寒能力，可根據秋眠級別的不同施以不同濃度的外源ABA或類似物。

3 苜蓿的秋眠性與抗寒性的關系

秋眠性是與日照變化有關的一種秋季生長特性，是對短日照的一種生長反應。在高緯度地區秋季日照長度的降低，引起苜蓿植株出現俯臥生長，且生長速度下降，這種特性即為苜蓿的秋眠性。具有這種特性的苜蓿品種即為秋眠苜蓿，而不表現這種現象的苜蓿則為非秋眠苜蓿。在極端秋眠和極端非秋眠的品種之間，還存在不同的過渡類型，并可以此將苜蓿品種分為不同的秋眠級［36］。國際上通常用秋眠級表示苜蓿抗寒能力的大小［37］。在國外，秋眠級別是苜蓿品種選擇首先需要考慮的因素。美國已把苜蓿秋眠性列為品種鑒定的一個首要指標。我國對苜蓿的秋眠性研究最早的是盧欣石［38］，他以美國9個秋眠標準對照品種為對照，對中國23個國家審定苜蓿品種進行了秋眠性評定，分析表明中國苜蓿國家審定品種中大部分為秋眠性品種。于林清等［39］在2000年同樣以美國9個秋眠性標準對照品種為參照，測定了我國新疆野生苜蓿種群117份材料的秋眠性，結果表明，新疆北疆苜蓿野生種群沒有半秋眠種質，參試的85份苜蓿品種中，秋眠級為1的84份，秋眠級為3的1份；而我國南疆的32份中1和3級品種分別為24和2份，4和5級的分別為4和2份。許多試驗表明，苜蓿品種的秋眠習性與其再生能力、潛在產量特別是苜蓿耐寒性高度相關。秋眠型苜蓿品種抗寒性強，但產量相對較低，再生較慢；非秋眠型苜蓿品種抗熱抗病性強，產量高，再生快，但耐寒性差；半秋眠型苜蓿品種介于兩者之間［40］。但是，也有學者認為秋眠性與抗寒性之間不存在因果關系，這2個性狀之間之所以密切關聯很可能與不同類型苜蓿的起源有關。秋眠性與抗寒性可以分離，有可能培育出既有旺盛的秋季生長（非秋眠性）、又有較強抗寒性（持久性）的苜蓿品種［32，41］。抗寒性與秋眠性的關系仍是今后研究中所要解決的問題之一。

4 生物技術在苜蓿抗寒育種中的應用

苜蓿抗寒育種以前主要依靠傳統的育種方法，但由于周期長、效果差且工作繁瑣，不能適應現代農業發展的需求［42］。最近10年來，隨著對抗寒分子機理認識的不斷加深以及生物技術的發展，人們不斷嘗試采用一些現代生物技術來培育抗寒新品種。楊志宏等［43］以準格爾苜蓿莖段誘導愈傷組織，對愈傷組織進行0～－10℃的低溫篩選，獲得抗寒性突變體，并用生理生化方法對突變的愈傷組織體細胞的抗寒性進行了鑒定，為抗寒育種提供了原始材料。李波等［44］對誘導的苜蓿愈傷組織進行不同濃度的硫酸二乙酯（DES）誘變處理，確定其半致死濃度，在－7℃低溫下進行篩選，已獲得抗寒性突變體；進行了相對電導率、游離脯氨酸含量、過氧化物酶的活性等抗寒生理指標的測定。結果表明，苜蓿愈傷組織經DES處理，DES的半致死濃度為0.3%，愈傷組織的抗寒性增強。李繼平［45］通過轉基因技術，將從擬南芥中克隆得到的冷誘導基因的轉錄因子CBF1轉入優質高產的苜蓿植株中，得到轉化植株，經過PCR分子檢測初步得到轉基因植株，為篩選出抗寒高產的轉基因苜蓿株系奠定了基礎。

5 輻射誘變與太空搭載對抗寒性影響

尚晨等［46］利用高能粒子場進行不同輻照劑量處理種子，研究龍牧803苜蓿M2代低溫下的生理變化，結果表明高能粒子處理紫花苜蓿種子提高了苜蓿的抗寒性，在低溫條件下，輻射劑量越高，輻射效應越明顯。張文娟［47］以4個高產紫花苜蓿品種優質種子為對象，通過返回式育種衛星“神州3號”搭載，返地后進行低溫脅迫處理，測定各種指標，結果表明，空間搭載對4個紫花苜蓿品種的質膜過氧化及細胞膜相對透性、游離脯氨酸含量有影響。低溫脅迫下，各品種搭載組與其對照組質膜透性、丙二醛含量都呈上升趨勢，搭載組質膜透性、丙二醛含量小于其對照，搭載組質膜過氧化程度小于對照；各品種搭載組與其對照組游離脯氨酸含量變化趨勢一致，但隨溫度下降，搭載組游離脯氨酸積累量大于其對照，這些生理變化都有利于苜蓿抗寒性的提升。

6 苜蓿抗寒性研究展望

由以上可知我們對苜蓿的抗寒性已經進行了多方面的研究，并且也取得了一定的研究成果，對苜蓿適應低溫的機理也有了一定的認識。但我國在苜蓿抗寒性的研究中還存在很多問題。比如：有哪些基因參與苜蓿的抗寒性形成，這些基因控制酶的形成進而影響表型變化的機制還有待于進一步研究；根系類型與抗寒性、在人工低溫脅迫下保護酶變化情況與抗寒性、苜蓿的秋眠性與抗寒性的關系還不是特別清楚；快速、簡潔、準確的鑒定苜蓿抗寒性的統一指標還未形成。如何在苜蓿抗寒性的研究中加大新的生物技術的應用，使傳統育種技術與現代育種技術相結合，加速育種進程，快速有效的提升苜蓿的抗寒性是我們今后需要努力的研究方向。

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