禽流感、新城疫血凝抑制試驗(yàn)影響因素分析

蔣作強(qiáng) 貴池區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 247000

車躍光 宿州市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 234000

血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)由于能同時(shí)進(jìn)行大量樣本分析,且因?yàn)榫哂性囼?yàn)過(guò)程易于操作以及結(jié)果快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)而成為我國(guó)各地動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)和養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、免疫程序制定及免疫效果監(jiān)測(cè)等的主要手段之一。盡管此監(jiān)測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確和實(shí)用,但是在實(shí)踐中由于某些因素的影響,也易導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,甚至無(wú)法判定。筆者根據(jù)多年的實(shí)踐操作將實(shí)驗(yàn)中的影響因素淺析如下。

1 血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)中常見(jiàn)問(wèn)題。

1.1 對(duì)照孔凝集。

1.2 全部凝集。

1.3 紅細(xì)胞全部下沉。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清的抗體效價(jià)與原結(jié)果誤差大于1個(gè)滴度。

1.5 淚滴狀流淌(完全血凝抑制)線細(xì)。

1.6 結(jié)果出現(xiàn)慢或結(jié)果出現(xiàn)快，并且整板無(wú)凝集現(xiàn)象。

1.7 凝集板出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象。

1.8 凝集不明顯，無(wú)法判定結(jié)果。

2 問(wèn)題產(chǎn)生的可能原因及應(yīng)對(duì)措施

2.1 樣品方面

2.1.1 被檢血清腐敗變性。血樣采集后要馬上分離血清，分離后及時(shí)測(cè)定或放置在4℃冰箱內(nèi)保存，力求新鮮。

2.1.2 受部分禽類血清中非特異性血凝抑制因子影響，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)會(huì)出現(xiàn)對(duì)照孔和對(duì)照孔后2～3孔有凝集現(xiàn)象。因此，在利用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行血清抗體測(cè)定之前，有必要對(duì)血清中非特異性因子進(jìn)行排除。

2.2 試劑器材方面

2.2.1 緩沖液配制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，pH值發(fā)生變化，使凝集不明顯。緩沖液（PBS）盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度和酸堿度要準(zhǔn)確，可用HCL和NAOH液調(diào)節(jié)酸堿度，并用pH試紙測(cè)試到pH值合適為止。如果用生理鹽水代替緩沖液，要使用新生產(chǎn)、新開瓶的生理鹽水。

2.2.2 4個(gè)血凝單位(HAU)抗原配制不準(zhǔn)確。為防止4個(gè)HAU抗原配制不準(zhǔn)確，在進(jìn)行HI試驗(yàn)前必須做4單位抗原校正。即在不加血清的情況下，第1～3孔的血球完全凝集，第4孔50%凝集呈點(diǎn)狀，說(shuō)明4單位抗原的配制可以使用。否則，需重新測(cè)定抗原效價(jià)，重新配制4個(gè)HAU抗原，并做4單位抗原校正，直至結(jié)果準(zhǔn)確。

2.2.3 紅細(xì)胞的來(lái)源。配制紅細(xì)胞懸液應(yīng)采集2只以上成年公雞的血，一般要求用非免疫公雞，如果用免疫公雞代替，應(yīng)增加洗滌次數(shù)和時(shí)間。

2.2.4 凝集板不干凈。目前，實(shí)驗(yàn)單位和基層多使用一次性96孔V型板，要保持板面及凹孔的干凈。若使用玻璃材料的96孔凝集板，V型孔底需光滑明亮,對(duì)底部磨損嚴(yán)重的反應(yīng)板要及時(shí)淘汰，使用后要按程序清洗干凈。

2.3 操作方面

2.3.1 在使用微量移液器時(shí)，液體加入量發(fā)生誤差。在使用微量移液器時(shí)，每個(gè)吸頭要安裝牢固，防止漏氣。操作時(shí)手壓下的力度要均勻。移液管嘴浸入液面下的深度要力求一致，不可過(guò)深，否則留在管嘴外的液體也滴入孔內(nèi)，吸取量增大，對(duì)抗體滴度產(chǎn)生影響。

2.3.2 在稀釋血清時(shí)，產(chǎn)生氣泡。倍比稀釋血清時(shí)，在吸取第一孔時(shí)要先按下移液器，再插入凝集板孔，吸取后加入第二孔。在反復(fù)抽取過(guò)程中，移液器滴頭不要離開液面，防止產(chǎn)生氣泡，造成移液量不準(zhǔn)。

2.3.3 樣品、抗原和紅細(xì)胞懸液在使用前沒(méi)有搖勻，加入時(shí)濃度高低不一，人為造成誤差。因此樣品、抗原和紅細(xì)胞使用前一定要搖勻，保證每一孔中加入的濃度準(zhǔn)確一致。

2.3.4 移液器滴加液體時(shí)，有時(shí)會(huì)將管嘴與凝集板孔相接觸，造成污染。尤其是在加入紅細(xì)胞懸液時(shí)，孔內(nèi)已有稀釋液、抗原、血清等，如果管嘴接觸到孔內(nèi)混合液，會(huì)造成各個(gè)孔內(nèi)液體相互污染。所以在使用移液器時(shí)，一定要保持加樣器管嘴與凝集板孔間的距離，以保證每個(gè)凝集孔內(nèi)液體數(shù)量和濃度準(zhǔn)確。

2.3.5 在凝集過(guò)程中振動(dòng)凝集板。有些操作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，急于想知道結(jié)果，將凝集板隨時(shí)取放，使凝集受到影響。因此在靜置過(guò)程中一定要有耐心，等時(shí)間到時(shí)再看結(jié)果，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2.3.6 抗原與抗體作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短對(duì)結(jié)果影響較大：過(guò)短出現(xiàn)凝集不完全，過(guò)長(zhǎng)出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象。

2.3.7 結(jié)果的判定。只有陰性、陽(yáng)性對(duì)照均成立，將凝集板傾斜45度后，流淌呈線狀的孔數(shù)為血凝抑制效價(jià)。

2.3.8 出現(xiàn)重復(fù)加樣或漏加樣的情況。

2.4 實(shí)驗(yàn)溫度

一般要求在室溫25℃～37℃的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)溫度過(guò)低，如低于15度時(shí)，出現(xiàn)結(jié)果就要慢，往往需要超過(guò)40分鐘才能出現(xiàn)清晰的結(jié)果。當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度低于4℃時(shí)紅細(xì)胞有時(shí)會(huì)發(fā)生自凝現(xiàn)象。當(dāng)試驗(yàn)過(guò)程中的環(huán)境溫度超過(guò)30℃時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)就快，往往在15分鐘左右就可讀數(shù)。一旦時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)果就會(huì)消失，使整板無(wú)凝集現(xiàn)象。

3 做好試驗(yàn)的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)

3.1 實(shí)驗(yàn)人員責(zé)任心要強(qiáng)

在進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)，由于受多方因素的影響，很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，所以要求實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)格操作，綜合考慮各方面的因素，正確判斷結(jié)果。當(dāng)出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)要認(rèn)真查找原因，及時(shí)總結(jié)，以免類似錯(cuò)誤再犯。

3.2 紅細(xì)胞洗滌要充分

原則上，血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)所用的紅細(xì)胞應(yīng)來(lái)源于SPF雞或非免疫的健康公雞，而實(shí)際上多使用免疫過(guò)的公雞。因此，對(duì)紅細(xì)胞的洗滌次數(shù)要多，要充分，并注意轉(zhuǎn)速和時(shí)間。至少洗滌5次，前4次為1500轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘；第5次為3000轉(zhuǎn)/分鐘，持續(xù)5～7分鐘。

3.3 4個(gè)血凝單位(HAU)抗原配制要準(zhǔn)確

在試驗(yàn)之前要對(duì)抗原用已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行標(biāo)定，以確定抗原的純度?？乖渲仆旰螅鑼?duì)其進(jìn)行標(biāo)定，看是否達(dá)到所需標(biāo)準(zhǔn)?？乖r(jià)過(guò)高或過(guò)低對(duì)結(jié)果都有一定的影響。過(guò)高，測(cè)定抗體效價(jià)偏低；過(guò)低，測(cè)定效價(jià)過(guò)高，甚至很高。4個(gè)HAU抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配，混懸液要混勻，配好的抗原在室溫下放置不得超過(guò)4小時(shí)。