不同方法測定瘤胃非降解蛋白質小腸消化率及相關性分析

王 燕 辛杭書 楊 方 陳常棟 張微微 李 敏 夏 科 張永根＊

飼料瘤胃非降解蛋白質（RUP）小腸消化率是影響奶牛的產奶量、生長性能的重要參數，因此，研究飼料RUP小腸消化率具有非常重要的意義。目前，國外對于應用移動尼龍袋法和三步體外法測定單一飼料蛋白質在小腸的消化率參數已有很多報道［1－3］，但國內研究很少，關于此方面的研究僅見于岳群等［4］和趙青余［5］的報道。在反芻動物小腸中，可代謝蛋白質是由瘤胃合成的微生物蛋白質、RUP及少量內源性蛋白質構成的［6］。研究證實，微生物蛋白質的小腸消化率為80%～85%［7］，在英國飼料評價系統中，飼料的RUP小腸消化率是90%［8］，而在 NRC（2001）［6］體系中，飼料RUP小腸消化率是80%。而大量試驗表明［1－3］，RUP小腸消化率受飼料類型、飼料來源和加工方式等因素的影響很大。目前，反芻動物飼料蛋白質小腸消化率常用的估測方法有移動尼龍袋法、體外法以及酸性洗滌不溶氮（ADIN）估測法等。Webester等［9］提出根據ADIN值預測可消化RUP，這種方法簡單快捷，是預測RUP小腸消化率最普遍的方法。移動尼龍袋法具有良好的重復性，且操作簡單，目前已被廣泛采用，但其仍依賴于裝有瘤胃瘺管和十二指腸瘺管的試驗動物，成本較高。近年來，隨著生理生化、酶學的發展，體外法也逐漸被人們所接受，雖然不能完全模擬體內的消化過程，但不需要試驗動物，且成本低、易操作、重復性好。Calsamiglia等［1］建立了綜合瘤胃尼龍袋法和三步體外法相結合的方法，較好地模擬了動物生理條件，省時省力，但原始三步體外法存在采用的胃蛋白酶（P－7012）價格昂貴，試驗過程中使用三氯乙酸造成環境污染，不能測定RUP小腸可消化氨基酸等弊端，因此，Gargallo等［10］建立了測定RUP小腸消化率的改進三步體外法。改進三步體外法能否替代移動尼龍袋法準確快速測定RUP小腸消化率成為本試驗研究的重點。本試驗應用移動尼龍袋法、改進三步體外法和原始三步體外法測定飼料RUP小腸消化率，并用ADIN估測法預測RUP小腸消化率，進而分別將改進三步體外法、原始三步體外法和ADIN估測法測定的結果與移動尼龍袋法的測定結果進行相關性分析，研究替代移動尼龍袋法測定RUP小腸消化率的適宜方法，并對飼料的常規營養成分和飼料RUP小腸消化率作回歸分析，找出簡單快速的測定RUP小腸消化率的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

13種待測樣品為豆粕（黑龍江）、棉籽粕（新疆）、菜籽粕（山東）、葵花粕（遼寧）、芝麻粕（山東）、玉米胚芽粕（吉林）、玉米（黑龍江）、米糠（黑龍江）、米糠餅（黑龍江）、米糠粕（黑龍江）、大麥（黑龍江）、麥麩（黑龍江）和玉米麩質飼料（吉林）。待測樣品粉碎過40目篩保存備用。

1.2 試驗飼糧及飼養管理

選擇3頭體重約560 kg的帶有永久瘤胃瘺管和十二指腸T型瘺管的奶牛作為試驗動物，每天09：00和17：00飼喂，每次飼喂5 kg精料，自由飲水。參照 NRC（2001）［6］標準配制精料，每千克精料包含235 g玉米、200 g干酒糟、150 g菜籽粕、140 g葵花粕、110 g米糠粕、60 g糖蜜、55 g甜菜粕、20 g礦物質和維生素。粗飼料自由采食。

1.3 試驗方法

根據Hvelplund［11］的方法獲得瘤胃培養16 h的非降解飼料殘渣，應用移動尼龍袋法測定RUP小腸消化率。原始三步體外法參照Calsa miglia等［1］的原理和方法，其中選用的胃蛋白酶（P－7012，美國Sig ma公司）活力≥2 500 U／mg prot，效價100%；選用的胰蛋白酶（P－7545，美國Sig ma公司）活力是8 USP U，效價100%。改進三步體外法步驟參照Gargallo等［10］的原理和方法，具體步驟如下：稱1 g殘渣放入尼龍袋（Anko m R510，孔徑50μm）里，熱封。在每個培養瓶內放入3個袋子，在瓶內放入預培養的鹽酸胃蛋白酶溶液［p H＝1.90，每升溶液中含有1 g胃蛋白酶（P－7000，美 國 Sigma 公 司），活 力 是 800～2 500 U／mg prot，效價是1∶10 000］，在39℃培養箱內振蕩培養1 h。培養后，沖掉所有的液體，用自來水沖至澄清為止。把袋子放入培養瓶中，加入2 L預熱的胰蛋白酶溶液［p H＝7.75，KH2PO4緩沖溶液，每升溶液中含有50μg的百里香酚和3 g的胰蛋白酶（P－7545，美國Sig ma公司，參數同上）］，在39℃培養箱內振蕩培養24 h，轉速為150 r／min。培養后，清洗小尼龍袋，直到水清為止。在55℃烘箱內烘48 h，分析袋內的氮含量。

1.4 計算公式

1.4.1 移動尼龍袋法測定RUP小腸消化率［4］

1.4.2 原始三步體外法和改進三步體外法測定RUP小腸消化率［1］

1.4.3 ADIN估測法預測RUP小腸消化率［6］

1.5 統計分析

數據的統計處理用SAS 6.12軟件包進行，以PROC REG過程對4種方法所測RUP小腸消化率數據進行線性回歸分析，方差分析采用one－way ANOVA過程進行，結果以平均值±標準差表示。以Step wise Multiple Regression過程對營養成分與RUP小腸消化率之間的關系進行回歸分析。

2 結 果

2.1 3種實測法測定的飼料RUP小腸消化率及相關性分析的結果

由表1可知，在蛋白質飼料中，移動尼龍袋法測定的豆粕RUP小腸消化率最高，依次是菜籽粕、棉籽粕、芝麻粕和葵花粕，最低的是玉米胚芽粕。在能量飼料中，移動尼龍袋法測定的玉米RUP小腸消化率最高，依次是米糠粕、大麥、玉米麩質飼料、米糠餅、麥麩和米糠，這說明玉米的蛋白質在瘤胃內不易降解，卻易被小腸消化利用。移動尼龍袋法測得的豆粕、玉米、米糠粕和大麥RUP小腸消化率較高，均在90%以上。玉米胚芽粕、麥麩、玉米麩質飼料、米糠RUP小腸消化率較低，在80%以下，其中米糠RUP小腸消化率最低（69.27%），加工后米糠（米糠餅和米糠粕）RUP小腸消化率提高，其中米糠粕RUP小腸消化率提高至90%以上。

在蛋白質飼料中，改進三步體外法測定結果除豆粕外，其余5種蛋白質飼料測定結果與移動尼龍袋法測定結果差異不顯著（P＞0.05）；在能量飼料中，改進三步體外法測定結果均顯著低于移動尼龍袋法測定結果（P＜0.05）。原始三步體外法的測定結果均顯著低于移動尼龍袋法測定結果（P＜0.05），除麥麩外，原始三步體外法測定結果也顯著低于改進三步體外法測定結果（P＜0.05）。

表1 3種實測法測定的飼料RUP小腸消化率Table 1 Small intestinal digestibility of RUP measured by the three measured methods %

如圖1和圖2所示，在蛋白質飼料中，移動尼龍袋法的測定結果與改進三步體外法的測定結果存在顯著相關（R2＝0.991 0，P＜0.05），在能量飼料中，這2種方法的測定結果也存在顯著相關（R2＝0.813 9，P＜0.05）；如圖3所示，在所測飼料中，2種方法的測定結果相關系數為0.838 3（P＜0.05）。如圖4和圖5所示，蛋白質飼料的移動尼龍袋法測定結果與原始三步體外法測定結果存在顯著相關（R2＝0.809 5，P＜0.05），能量飼料的移動尼龍袋法測定結果與原始三步體外法測定結果也存在顯著相關（R2＝0.807 7，P＜0.05）；如圖6所示，在所測飼料中，移動尼龍袋法與原始三步體外法的測定結果相關系數為0.789 9（P＜0.05）。

圖1 蛋白質飼料移動尼龍袋法與改進三步體外法測定結果的相關性分析Fig.1 Correlation analysis bet ween MBT and MTSP measured results of pr otein f eed

圖2 能量飼料移動尼龍袋法與改進三步體外法測定結果的相關性分析Fig.2 Correlation analysis bet ween MBT and MTSP measured results of energy feed

圖3 所測飼料移動尼龍袋法與改進三步體外法測定結果的相關性分析Fig.3 Correlation analysis bet ween MBT and MTSP measured results of all feeds

2.2 ADIN估算法預測的飼料RUP小腸消化率結果及其與移動尼龍袋法測定結果的相關性

由表2可知，ADIN估測法預測的蛋白質飼料RUP小腸消化率中，最高的是豆粕，依次是芝麻粕、葵花粕、棉籽粕、菜籽粕，最低的是玉米胚芽粕。ADIN估測法預測的能量飼料RUP小腸消化率中，最高的是大麥，依次是玉米麩質飼料、玉米、米糠餅、米糠和麥麩，最低的是米糠粕。ADIN估測法預測結果與移動尼龍袋法測定結果相比，2種方法得到葵花粕、米糠餅、麥麩、玉米麩質飼料的結果無顯著差異（P＞0.05），表明ADIN估算法能預測葵花粕、米糠餅、麥麩和玉米麩質飼料RUP小腸消化率。ADIN估測法得到的芝麻粕和米糠RUP小腸消化率顯著高于移動尼龍袋法測定的RUP小腸消化率（P＜0.05），得到的豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米胚芽粕、玉米、米糠粕、大麥RUP小腸消化率均顯著低于移動尼龍袋法測定的RUP小腸消化率（P＜0.05）。

圖4 蛋白質飼料移動尼龍袋法與原始三步體外法測定結果的相關性分析Fig.4 Correlation analysis bet ween MBT and TSP measured results of pr otein feed

圖5 能量飼料移動尼龍袋法與原始三步體外法測定結果的相關性分析Fig.5 Correlation analysis bet ween MBT and TSP measured results of energy f eed

圖6 所測飼料移動尼龍袋法與原始三步體外法測定結果的相關性分析Fig.6 Correlation analysis bet ween MBT and TSP measured results of all f eeds

如圖7、圖8和圖9所示，蛋白質飼料、能量飼料及所測飼料的ADIN估測法預測結果與移動尼龍袋法測定結果均無顯著的相關（P＞0.05）。

2.3 所測飼料的常規營養成分含量與RUP小腸消化率的回歸關系

所測飼料的常規營養成分含量及移動尼龍袋法測定的RUP小腸消化率，如表3所示，將二者進行遞推回歸分析，得到回歸方程，如表4所示。由表4第5個方程可知，RUP小腸消化率與粗蛋白質（CP）、可溶性蛋白質（SP）、中性洗滌纖維（NDF）、粗脂肪（EE）、凈能（NE）呈顯著相關，飼料的RUP小腸消化率與CP的含量呈正相關，與SP、NDF、EE和NE含量呈負相關，當引入的變量越多，回歸方程系數越大，當引入CP、SP、NDF、EE、NE這5個變量時，回歸方程：RUP小腸消化率（y）＝121.44 ＋ 0.40 CP －0.69SP－ 0.58 NDF －1.04EE－11.20 NE（R2＝0.801 1，P＝0.010 0）。

表2 移動尼龍袋法和ADIN估測法得出的RUP小腸消化率（干物質基礎）Table 2 Small intestinal digestibility of RUP measured by MBT and ADIN （DM basis） %

圖7 蛋白質飼料移動尼龍袋法測定結果與ADIN估測法預測結果的相關性分析Fig.7 Correlation analysis bet ween MBT measured results and ADIN esti mated results of pr otein feed

圖8 能量飼料移動尼龍袋法測定結果與ADIN估測法預測結果的相關性分析Fig.8 Correlation analysis bet ween MBT measured results and ADIN esti mated results of energy feed

圖9 所測飼料移動尼龍袋法測定結果與ADIN估測法預測結果的相關性分析Fig.9 Correlation analysis bet ween MBT measured results and ADIN esti mated results of all feeds

3 討 論

3.1 3種實測法測定的不同飼料RUP小腸消化率的比較與分析

在蛋白質飼料中，除豆粕外，移動尼龍袋法測定的RUP小腸消化率與改進三步體外法測定的RUP小腸消化率無差異，表明改進三步體外法完全能替代移動尼龍袋法測定棉籽粕、菜籽粕、葵花粕、芝麻粕和玉米胚芽粕的RUP小腸消化率。對所測大多數飼料來說，2種體外法測定值普遍低于移動尼龍袋法測定值，這一方面是由于移動尼龍袋法經過了大腸消化的緣故［4］，另一方面可能是由于體內的復合酶能分解部分不易消化的蛋白質的緣故。

表3 所測飼料的常規營養成分含量及RUP小腸消化率 （干物質基礎）Table 3 Conventional nutrient contents of measured feeds and small intestinal digestibility of RUP（DM basis） %

表4 預測RUP小腸消化率的回歸方程 （干物質基礎）Table 4 The regression equation of esti mated small intestinal digestibility of RUP（DM basis）

Woods等［12］采用移動尼龍袋法和原始三步體外法對棉籽粕、菜籽粕、葵花粕、大麥等飼料的RUP小腸消化率進行了測定，得出移動尼龍袋法測定的豆粕、棉籽粕的結果與本試驗的結果接近，而大麥和葵花粕的測定結果比本試驗測定結果偏低，這可能與飼料的品種及產地來源等因素有關。米糠加工后，RUP小腸消化率提高，其中米糠粕的RUP小腸消化率提高至90%以上，表明米糠加工后易于被小腸吸收利用，從而提高飼料的轉化效率。由此可知，飼料的RUP小腸消化率受飼料品種及加工方式等因素的影響很大。反芻動物中，飼料在瘤胃內被降解是一種低效的過程，Chalpua等［13］指出，飼糧蛋白質應盡量避免瘤胃降解，為小腸的消化利用供應充足的氨基酸。根據飼料蛋白質、瘤胃降解蛋白質和RUP對產奶量、乳蛋白質含量的回歸方程得出，產奶量和乳蛋白質含量會隨著RUP含量的增加而增加。

改進三步體外法測定的米糠粕的結果比移動尼龍袋法測定結果低12.17%，原始三步體外法測定值比移動尼龍袋法測定值低19.17%，這與米糠在加工過程中產生抗營養因子有關，也可能是由于飼料原料的特性（CP、NDF、ADF等的含量）不同及操作方法細節（瘤胃內預培養的時間、移動尼龍袋的孔徑）不同引起的。本試驗所測得的試驗數據除菜籽粕偏高外，其余飼料的測定結果與NRC（2001）［6］所列出的試驗的結果（包括48個移動尼龍袋測定結果和6個三步體外法測定結果）的平均值接近，這可能由于菜籽粕的加工工藝不同導致抗營養因子發揮的作用不同所致。

由圖1和圖2所示，移動尼龍袋法和改進三步體外法測定能量飼料的相關系數（0.813 9）明顯低于蛋白質飼料的相關系數（0.991 0），這表明改進三步體外法替代移動尼龍袋法測定蛋白質飼料的RUP小腸消化率比測定能量飼料的RUP小腸消化率效果更好。如圖4和圖5所示，移動尼龍袋法和原始三步體外法測定能量飼料的相關系數（0.807 7）低于蛋白質飼料的相關系數（0.809 5），這表明采用原始三步體外法替代移動尼龍袋法測定蛋白質飼料的RUP小腸消化率比測定能量飼料的RUP小腸消化率效果要好。如圖3和圖6所示，在所測飼料中，移動尼龍袋法測定結果與改進三步體外法測定結果的相關系數（0.838 3）也高于移動尼龍袋法與原始三步體外法測定結果的相關系數（0.789 9），這表明改進三步體外法比原始三步體外法能更好地替代移動尼龍袋法測定飼料RUP小腸消化率。Antoniewicz等［14］測定了不同來源的4種蛋白質補充料，得出移動尼龍袋法和三步體外法測定值有較強的相關（R2＝0.810 0，P＜0.05）。Van Straalen等［15］也報道了這2種方法有很強的相關（R2＝0.900 0）。Woods等［12］測定了豆粕、葵花粕、菜籽粕、棉籽粕、棕櫚粕、大麥等12種飼料的RUP小腸消化率，得出這2種方法的測定結果有很強的相關（R2＝0.910 2）。岳群等［4］和趙青余［5］均認為體外法測定的小腸消化率與移動尼龍袋法測定的小腸消化率存在顯著的相關性。

在所測飼料中，改進三步體外法測定的結果與移動尼龍袋法測定結果的相關系數顯著高于原始三步體外法與移動尼龍袋法測定結果的相關系數，這說明改進三步體外法能更準確地模擬小腸環境，從而更準確地測定RUP小腸消化率。另外改進三步體外法主要有以下優點：1）改進三步體外法使用的胃蛋白酶（P－7000）與原始三步體外法使用的胃蛋白酶（P－7012）相比，價格降低22倍［11］，大大降低了成本；2）原始三步體外法采用三氯乙酸終止蛋白質反應，三氯乙酸具有強腐蝕性和強氧化性，造成環境污染，改進三步體外法取消了三氯乙酸的使用；3）改進三步體外法能測定過瘤胃氨基酸的小腸消化率，而原始三步體外法不能。

3.2 移動尼龍袋法與ADIN估測法的比較分析

ADIN估測法預測的葵花粕、米糠餅、麥麩和玉米麩質飼料的結果與移動尼龍袋法測定結果無顯著差異，表明ADIN估測法能替代移動尼龍袋法得到葵花粕、米糠餅、麥麩和玉米麩質飼料的RUP小腸消化率。如圖7、圖8和圖9所示，在蛋白質飼料、能量飼料及所測飼料中，ADIN估測法預測結果與移動尼龍袋法測定結果無顯著相關，這表明ADIN估測法只針對某種特定的飼料，而不能替代移動尼龍袋法測定所有飼料RUP小腸消化 率。Naka maur等［16］和 Rogers等［17］研 究 提出，非牧草類植物來源的蛋白質在加熱處理后ADIN和氮的消化率之間存在弱相關，試驗數據表明，飼料經過加工后會誘發美拉德反應，從而使ADIN含量增加，然而飼料原料中ADIN部分可以被消化。因此，目前分辨不出ADIN消化的具體位置（瘤胃、小腸）以及其消化程度，也不清楚熱損害吸收的氮是否利于奶牛的生長，因此，ADIN估測法對于測定RUP小腸消化率不一定適用［6］。

3.3 飼料常規營養成分含量與RUP小腸消化率的回歸關系分析

ADIN估測法顯然不能代替移動尼龍袋法測定飼料RUP小腸消化率，三步體外法測定RUP小腸消化率也存在酶價格高、周期長等弊端，因此，需要找到一種能快速準確預測RUP小腸消化率的方法。本試驗結果表明，飼料RUP小腸消化率與CP、SP、NDF、EE、NE含量呈顯著相關，與CP的含量呈正相關，而與SP、NDF、EE和NE含量呈負相關，且NE的系數絕對值最大，表明NE的大小直接影響著飼料RUP小腸消化率的高低。飼料的RUP小腸消化率與飼料的常規營養成分含量顯著相關，引入的常規營養成分指標越多，回歸方程的R2越大，當引入CP、SP、NDF和EE時，R2已達到0.750 3，當引入 CP、SP、NDF、EE和 NE時，R2達到0.801 1，能準確快速預測RUP小腸消化率。而 Woods等［12］也得出營養成分與體外法相關方程的相關系數為0.78。因此，在沒有瘺管動物或三步體外法條件不允許的情況下，采用此種方法預測RUP小腸消化率比采用ADIN估測法得到的RUP小腸消化率準確得多。

4 結 論

① 應用原始三步體外法和改進三步體外法均可替代移動尼龍袋法測定飼料RUP小腸消化率，其中改進三步體外法替代移動尼龍袋法測定RUP小腸消化率效果更好，并且應用體外法替代移動尼龍袋法測定蛋白質飼料RUP小腸消化率比測定能量飼料RUP小腸消化率效果更好。

②ADIN估測法具有局限性，用飼料的常規營養成分含量可較好地預測RUP小腸消化率。

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