介入干預前后胃癌患者hTERT蛋白及mRNA的變化

王昕升 宋愛華 張健

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，位居消化系統腫瘤之首［1］。端粒酶是現代生物醫學領域研究的熱點之一，在胃癌組織中端粒酶陽性表達率高達80% ～90%［2］，其活性高低與細胞永生化及胃癌發生密切相關。研究表明，端粒酶的激活及其活性上調主要取決于其催化亞基端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的表達水平［1］。本研究通過對胃癌患者行靜脈化療和動脈介入術，測定干預前后胃癌組織hTERT蛋白及mRNA表達水平，為判定臨床治療效果及預后提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月至2010年10月經我院病理確診并接受介入干預治療的胃癌患者30例(介入干預組)，其中男21例，女9例;平均年齡(61±11)歲;中分化腺癌10例，低分化腺癌20例;賁門部位14例，胃角部位2例，胃體部位3例，胃竇部位11例;伴有轉移者16例，無轉移者15例。另選取20例胃癌患者為對照行全身化療(靜脈化療組)，其中男12例，女8例;年齡(58±11)歲。20例胃癌中，中分化腺癌7例，低分化腺癌13例;賁門部位10例，胃角部位1例，胃體部位5例，胃竇部位4例;伴有轉移者12例、無轉移者8例。另取10例正常胃黏膜作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 干預方法:采用seldinger法對胃癌患者行股動脈穿刺插管，經腹腔動脈造影確認腫瘤供血動脈。之后將導管置入靶血管內，血流變慢后緩慢注入化療藥物栓塞。藥物選用5-氟脲嘧啶、亞葉酸鈣、草酸鉑、表阿酶素、明膠海棉。根據胃癌發生部位不同選擇不同的靶血管:賁門部位選擇胃左動脈，胃竇和胃角部位選用胃右動脈，胃體部位選擇肝總動脈。腹腔動脈造影發現有肝轉移者行選擇性肝動脈灌注化療栓塞。2次干預間隔3～4周。對照組行全身化療，藥物選用5-氟脲嘧啶、亞葉酸鈣、草酸鉑。干預時間為2周期。

1.2.2 端粒酶hTERT蛋白及mRNA表達水平的檢測:采用免疫組織化學法檢測hTERT蛋白表達，以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。hTERT蛋白陽性染色的判定標準為細胞質或細胞核內檢出棕黃色顆粒。隨機選取5個有代表性的視野計數200個細胞，若陽性細胞占同類細胞的百分比＜10%即為陰性，＞10%則為陽性。采用原位雜交法檢測hTERT mRNA表達水平。hTERT mRNA陽性染色的判定標準及半定量分析方法同免疫組化法。

1.3 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組hTERT蛋白的表達 正常胃黏膜hTERT蛋白表達陽性率為10%(1/10)，胃癌組織hTERT蛋白表達陽性率為78%(39/50)，顯著高于正常胃黏膜(χ2=16.34，P＜0.05)。見表1。

表1 正常胃黏膜與胃癌hTERT蛋白表達水平 例

2.2 2組hTERT mRNA的表達 正常胃黏膜hTERT mRNA表達陽性率為0(0/10)，胃癌組織中hTERT mRNA表達陽性率為64%(32/50)，顯著高于正常胃黏膜(χ2=12.24，P＜0.05)。見表 2。

表2 正常胃黏膜與胃癌hTERT mRNA表達水平 例

2.3 介入干預和靜脈化療組一般資料的比較 2組在年齡、性別構成比例、癌細胞病理分型、癌變部位方面比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 介入干預組和靜脈化療組一般資料的比較

2.4 介入干預和靜脈化療組治療前后hTERT蛋白及mRNA表達的比較 與干預前比較，2組干預后hTERT蛋白及mRNA水平明顯降低(P＜0.05)，且干預后4周與干預后2周比較差異亦有統計學意義(P＜0.05)。與靜脈化療組比較，介入干預組hTERT蛋白及mRNA水平變化更為明顯(F值分別為4.299和4.065，P＜0.05)。見表 4。

表4 3組治療前后hTERT蛋白及mRNA表達的比較 例(%)

3 討論

胃癌是常見的消化道腫瘤，其病變過程涉及多種因子參與，包括癌基因激活，抑癌基因失活，端粒及端粒酶活性增高，細胞黏附分子及DNA錯配修復基因的異常和積累等。惡性腫瘤發病的重要原因是腫瘤細胞獲得永生性，而這一特性的結構基礎在于細胞端粒酶活性的上調［3，4］。端粒酶是廣泛存在于永生化細胞和腫瘤細胞的一種核糖核蛋白酶，全酶包括三個主要部分:即端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相關蛋白(TP1)和端粒酶逆轉錄酶(hTERT)，其功能不僅可維持端粒的長度，保持染色體的穩定，而且在細胞的惡性轉化和腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用［5］。在端粒酶的三個組成部分中，hTERT的活性是端粒酶激活的限速步驟。多項研究報道，hTERT基因與端粒酶活性具有密切的相關性，hTERT活性變化可直接反映端粒酶的活性變化。最近研究發現端粒酶和hTERT蛋白在胃癌中表達率顯著提高，參與了正常胃黏膜惡性轉化的全過程。

本文以正常胃黏膜hTERT基因表達水平為對照，檢測了靜脈化療和介入干預治療前后胃癌患者hTERT基因表達水平的變化，結果表明:hTERT基因在正常人胃黏膜不表達或很少表達(其中蛋白表達陽性率為10%，mRNA表達陽性率為0)。與正常胃黏膜比較，胃癌患者組織hTERT基因呈現高表達(其中蛋白表達陽性率為78%，mRNA表達陽性率為64%)，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示在正常胃黏膜組織中hTERT基因幾乎不表達，當受到外界或內部相關信號分子的刺激后，hTERT基因表達上調，端粒酶被激活，端粒長度不再縮短，從而促進細胞增殖和生長進而發生惡變。但我們注意到，正常人和胃癌組織hTERT基因表達在mRNA水平低于蛋白水平的表達。考慮到RNA酶在大自然界中的廣泛存在，造成mRNA極其容易被降解，因此我們推測這可能與標本中mRNA的降解有關。

我們還觀察到與干預前相比，動脈介入干預組hTERT基因表達水平明顯低于靜脈化療組，提示動脈介入治療對胃癌的治療效果顯著優于靜脈化療組。并且隨著干預治療時間的延長hTERT基因表達水平降低更為顯著，說明hTERT表達水平與胃癌的病情發展密切相關。因此，監測hTERT基因表達水平有利于對胃癌治療效果做出較為準確的判斷，同時可用于評價預后。

1 Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009.CA Cancer J Clin，2009，59:225-249.

2 祝蔭，呂農華，陳江，等.H pylori在胃癌前病變中對端粒酶相關基因及細胞增殖與凋亡的影響.世界華人消化雜志，2009，17:1448-1453.

3 Shan YS，Hsieh YH，Lin PW.Telomerase activity in tumor and remnant liver as predictor of recurrence and surival in hepatocellular carcinoma after resection.World J Surg，2007，31:1121-1128.

4 Sampedro CF，Cano SG，Sampedro SF，et al.Telomerase and telomere dynamics in ageing and cancer:current status and future directions.Clin Transl Oncol，2007，9:145-154.

5 Hahn WC，Meyerson M.Telomerase activation，cellular immortalization and cancer.Ann Med 2001，33:123-129.