磷酸化STAT3和Bcl-2在子宮內膜異位癥的表達及相互關系

孟津 趙敏 金海紅 陳燕

子宮內膜異位癥(EMs)是一種育齡女性常見病，嚴重影響患者生活質量。目前發病機制不明，治療后復發率高?！霸谖粌饶Q定論”指出:子宮內膜碎片必須經黏附、侵襲、血管形成，方可生存、生長，并引起病變和癥狀［1］。這一過程的完成是以不同在位內膜的不同生物學特性、甚至基因差異為基礎。信號傳導和轉錄激活因子3(STAT3)廣泛參與腫瘤的侵襲轉移、血管發生、凋亡抵抗和免疫逃避等，可能在EMs的發病中發揮重要作用。磷酸化STAT3(P-STAT3)是STAT3的活化形式。B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)是STAT3重要的靶基因，也是重要的抗凋亡基因之一，與EMs的發生發展有密切關系。本實驗采用免疫組化SP法研究P-STAT3和Bcl-2在EMs的在位內膜、異位內膜中的表達，分析它們在不同內膜組織中表達的相關性，探討兩者在EMs發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究組:選取秦皇島市第一醫院婦科2008年1月至2011年1月手術及病理證實的EMs患者40例，包括增殖期23例，分泌期17例。患者年齡23～46歲，平均年齡(38±5)歲，平均體重指數(23.2 ±2.4)kg/cm2。采用 1985 美國生育協會的EMs分期標準(r-AFS):Ⅰ期3例，Ⅱ期8例，Ⅲ期12例，Ⅳ期17例。術中取得在位內膜和異位內膜標本各40例。對照組:正常子宮內膜標本40例，包括增殖期25例，分泌期15例，年齡27～49歲，平均年齡(38±5)歲，平均體重指數(22.9±2.5)kg/cm2。2組間年齡和體重指數差異無統計學意義(P＞0.05)。全部患者月經規律，除外妊娠、哺乳期女性，無惡性腫瘤及其他內科外科、婦科合并癥，術前6個月內未接受激素治療。

1.2 主要試劑 兔抗人P-STAT3多克隆抗體購自美國CST公司。鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 方法 標本經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，制成4μm厚連續切片。經常規脫蠟、脫苯、封閉內源性過氧化物酶及抗原修復等步驟，按照試劑盒說明書行免疫組化SP染色，中性樹膠封片后置于顯微鏡下觀察。PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷 P-STAT3結果判定以子宮內膜腺上皮細胞的細胞核著色為陽性細胞，Bcl-2結果判定以子宮內膜腺上皮細胞的細胞漿著色為陽性。參照Fromowitz等［2］的半定量積分法，以染色強度和染色范圍進行結果判定。染色強度分為:不染色0分;淡黃色1分;黃色2分，棕黃色3分。染色范圍:隨機選取10個具有代表性的高倍鏡視野(×400)，每視野計數100個腺上皮細胞，按照陽性細胞百分率分為:0～5%計0分，6%～25%計1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計3分。每張切片的兩分數相加計算總分:0～2分為陰性(－)，3分為弱陽性(+)，4分為陽性(++)，5～7分為強陽性(+++)。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，采用t檢驗、檢驗χ2非參數Wilcoxon W檢驗、McNemar檢驗、Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P-STAT3的表達 P-STAT3蛋白在對照組和研究組在位及異位內膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞核，間質也有少量表達。組間比較:P-STAT3蛋白的表達強度在研究組在位內膜高于對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期對照組;在研究組異位內膜高于在位內膜和對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期的在位內膜和對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。同組增殖期與分泌期比較:P-STAT3蛋白的表達強度在對照組分泌期高于增殖期，差異有統計學意義(P＜0.05)。在研究組在位內膜和異位內膜的表達強度，增殖期與分泌期比較均差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1、圖1～3。

表1 P-STAT3在不同子宮內膜中的表達 例

圖1 P-STAT3在對照組子宮內膜的陽性表達(SP×400)

圖2 P-STAT3在研究組在位內膜的陽性表達(SP×400)

圖3 P-STAT3在研究組異位內膜的陽性表達(SP×400)

2.2 BCL-2的表達 Bcl-2蛋白在對照組子宮內膜和研究組在位及異位內膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞漿中，基質中也有表達。組間比較:Bcl-2蛋白的表達強度在研究組在位內膜高于對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期對照組;Bcl-2蛋白的表達強度在研究組異位內膜高于在位內膜和對照組，且增殖期和分泌期的表達強度均高于同期的在位內膜和對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。同組增殖期與分泌期比較:Bcl-2蛋白的表達強度在對照組和研究組在位內膜中增殖期高于分泌期，差異有統計學意義(P＜0.05)。在研究組異位內膜中的表達強度，增殖期與分泌期比較均差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2、圖4。

表2 Bcl-2在不同子宮內膜中的表達 例

圖4 Bcl-2在研究組在位內膜中的陽性表達(SP法×100)

2.3 STAT3與Bcl-2表達的相關性分析 研究組在位內膜的增殖期中P-STAT3和Bcl-2的表達強度呈正相關(r=0.89，P=0.00)，分泌期中P-STAT3和Bcl-2的表達強度呈正相關(r=0.87，P=0.00);研究組異位內膜的增殖期中 P-STAT3和Bcl-2的表達強度呈正相關(r=0.94，P=0.00)，分泌期中 PSTAT3和 Bcl-2的表達強度呈正相關(r=0.98，P=0.00)。對照組的增殖期中P-STAT3和Bcl-2無相關性(P=0.06);分泌期中P-STAT3和Bcl-2的表達強度無相關性(P=0.17)。

3 討論

3.1 STAT3與EMs的關系 STAT3是重要的癌基因，其過度激活與腫瘤的異常增生、侵襲轉移、凋亡抵抗、血管發生和免疫抑制等密切相關。而異位內膜類似腫瘤的生物學行為是EMs發病的關鍵［3］。STAT3可能通過參與凋亡抵抗、血管生成、侵襲轉移和免疫逃避等途徑參與EMs發病。

3.1.1 P-STAT3在正常子宮內膜的表達和意義:Dimitriadis等［4］認為，P-STAT3免疫反應性在月經周期的分泌期最大化，在分泌中期子宮內膜容受囊胚植入時達峰值。本研究表明，PSTAT3在分泌期的表達高于增殖期，支持STAT3參與子宮內膜蛻膜化的觀點。

3.1.2 P-STAT3在 EMs的表達和意義:本研究發現，P-STAT3在在位及異位內膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞核，與正常子宮內膜中的表達一致［4］。P-STAT3在在位和異位內膜中高表達，且與月經周期不同時相無關，表明P-STAT3的異常可能是EMs的發病原因。P-STAT3在在位內膜中高表達，且在在位和異位內膜中都失去周期性變化，提示在位內膜參與EMs發病，并可能是其中關鍵，這符合“在位內膜決定論”的觀點。研究同時發現，P-STAT3在異位內膜中高表達，與月經周期不同時相無關。提示在位內膜的變化可能不是引發EMs的唯一原因，腹腔內環境的改變很可能也參與其中，這與Ryan等［5］的觀點相符。

3.2 Bcl-2與EMs的關系 凋亡在EMs發生發展中的作用日益受到重視。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，其異常表達可能通過改變子宮內膜的正常凋亡促成EMs發病。

3.2.1 Bcl-2在正常子宮內膜的表達和意義:本研究發現，Bcl-2在正常子宮內膜中主要表達在腺上皮細胞的細胞漿，增殖期的表達高于分泌期。這與Gompel等［6］的研究結果一致，提示其參與調控子宮內膜的周期性改變。

3.2.2 Bcl-2在EMs的表達和意義:本研究發現，Bcl-2在在位和異位內膜中均主要表達在腺上皮細胞的細胞漿，與在正常子宮內膜的表達一致。Bcl-2在在位和異位內膜中高表達，且與月經周期不同時相無關。Bcl-2在在位內膜中的表達增殖期高于分泌期，在異位內膜中失去周期性變化。這與Watanabe等［7］的研究結果一致，提示Bcl-2的異常可能參與EMs發病。本研究表明，Bcl-2在異位內膜中的表達高于在位內膜，并失去周期性變化，提示在位內膜中Bcl-2的變化可能參與子宮內膜的發病，但腹腔內環境的改變進一步影響Bcl-2的表達，并可能最終促成EMs的發生。

3.3 EMs的在位內膜和異位內膜中STAT3與 Bcl-2表達的關系 本研究表明，P-STAT3和Bcl-2在不同月經周期的正常子宮內膜中的表達強度不相關，而在不同月經周期的在位和異位內膜中分別呈正相關。提示上調Bcl-2的表達是STAT3促進EMs發病的可能途徑。

綜上所述，P-STAT3和Bcl-2在EMs的發病中發揮重要作用。STAT3通路通過對Bcl-2的調控改變子宮內膜的正常凋亡是其參與EMs發病的可能方式之一，與腹腔內環境中基因的變化共同促成EMs的發生。

1 郎景和.子宮內膜異位癥研究的新里程.中華婦產科雜志，2005，40:3-4.

2 Fromowitz FB，Viola MV，Chao S，et al.Ras p21 expression in the progression of breast cancer.Hum Pathol，1987，18:1268-1275.

3 Harada T，Taniguchi F，Izawa M，et al.Apoptosis and endometriosis.Front Biosci，2007，12:3140-3151.

4 Dimitriadis E，Stoikos C，Tan YL，et al.Interleukin 11 signaling components signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)and suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3)regulate human endometrial stromal cell differentiation.Endocrinology，2006，147:3809-3817.

5 Ryan IP，Taylor RN.Endometriosis and infertility:new concepts.Obstet Gynecol Surv，1997，52:365-371.

6 Gompel A，Sabourin JC，Martin A，et al.Bcl-2 expression in normal endometrium during the menstrual cycle.Am J Pathol，1994，144:1195-1202.

7 Watanabe H，Kanzaki H，Narukawa S，et al.Bcl-2 and Fas expression in eutopic andectopic human endometrium during the menstrual cycle in relation to endometrial cell apoptosis.Am J Obstet Gynecol，1997，176:360-368.