HPLC法同時測定纈沙坦氫氯噻嗪膠囊中纈沙坦和氫氯噻嗪的含量

吳迪，郭偉英（遼寧醫學院，遼寧錦州121001）

纈沙坦氫氯噻嗪膠囊是由纈沙坦和氫氯噻嗪組成的復方制劑，用于治療單一藥物不能充分控制血壓的輕-中度原發性高血壓。纈沙坦作為一種血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體拮抗藥，是90年代出現的新型抗高血壓藥物。纈沙坦安全而療效肯定，優于鈣拮抗藥、噻嗪類利尿劑和血管緊張素轉換酶抑制劑[1]。但當纈沙坦的使用劑量增加到一定水平后，其藥效并不隨劑量增強，多數患者的治療需與其他降壓藥聯合應用才能達到有效降壓目的[2]，因此，纈沙坦氫氯噻嗪膠囊制劑的出現是解決以上問題的較好方案[3，4]。

噻嗪類利尿劑主要作用部位為髓袢升支皮質部及遠曲小管起始部，短期使用時主要通過抑制鈉離子、氯離子和水的重吸收，達到排鈉利尿作用，使血容量和細胞外液減少、心輸出量下降，從而達到降壓作用。而長期使用利尿劑后血容量不會進一步下降，這時噻嗪類利尿劑可通過直接舒張血管、降低血管順應性而使血壓降低[5]。此外，單用氫氯噻嗪還可能引發低血鉀癥，當其與纈沙坦聯合應用時則可以減少低血鉀的發生，原因是纈沙坦既可以減少利尿劑的用量又能減輕因利尿劑引起的電解質變化[2]。因此，相關文獻中專家建議沙坦類降壓藥物應與利尿劑同時使用。

纈沙坦單方制劑[6]和氫氯噻嗪單成分含量測定方法也已有報道[7]，但是報道中方法大多操作煩瑣、誤差范圍大、流動相中含有緩沖鹽溶液，這樣不利于試驗的簡便操作或不利于色譜柱的保護，本課題采用的高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）法只要求樣品制成溶液，且選用制備簡單、含酸的流動相，對色譜柱損傷相對較小，同時還具有分辨率高、靈敏度高、速度快等優點，能在同一種條件下同時測定出2種成分的含量，既節省時間又可以保證測定的準確度和精密度等要求，所以本文采用此法測定該制劑中纈沙坦和氫氯噻嗪的含量。

1 儀器與試藥

FL2200液相色譜儀、FL2200 UV檢測器、FL9500色譜工作站（浙江溫嶺福立分析儀器有限公司）；KQ-100A型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD型電子天平（德國賽多利斯公司）。

纈沙坦標準品（批號:100651-200902，純度:98.9%）、氫氯噻嗪標準品（批號:100309-200702，純度:99.8%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；纈沙坦氫氯噻嗪膠囊（山東魯抗辰欣藥業有限公司，批號:100324201、100328201、100528204，每粒膠囊含纈沙坦80 mg、氫氯噻嗪12.5 mg）；甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合標準品溶液的制備。精密稱取纈沙坦和氫氯噻嗪標準品80、12.5 mg，置于同一100 mL量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得標準品貯備液。精密吸取此貯備液10 mL置于100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備。取纈沙坦氫氯噻嗪膠囊10粒，去除膠囊殼精密稱取內容物適量（約相當于纈沙坦80 mg），置于100 mL量瓶中，加流動相適量，超聲溶解，放冷，用流動相定容，搖勻，濾過。精密量取續濾液10 mL，置于100 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，靜置，吸取上清液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品液的制備。取處方組成中除纈沙坦和氫氯噻嗪外的其他成分，制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法處理得陰性樣品液。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Chromatrex C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:甲醇-水（70∶30，用磷酸調pH至3.1），流速:1.0 mL·min－1；檢測波長:230 nm；柱溫:25℃；進樣量:20 μL。理論板數按纈沙坦和氫氯噻嗪計算均在4 000以上，分離度均＞1.5，陰性樣品液不干擾測定。標準品、供試品和陰性樣品色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

由圖1表明，在本試驗色譜條件下，樣品中其他成分對纈沙坦和氫氯噻嗪的測定無干擾，氫氯噻嗪和纈沙坦保留時間分別約為2.6、7.9 min。

2.3 線性關系考察

分別精密量取標準品貯備液1、2、5、10、15、20 mL，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解定容，搖勻，即得系列溶液。分別取上述溶液進樣測定，以峰面積（A）為縱坐標，進樣濃度（c）為橫坐標，進行線性回歸，得纈沙坦和氫氯噻嗪回歸方程分別為A＝4.723 6×104c+4.008 6×105（r＝0.999 7）、A＝7.024 4×104c+2.790 4×104（r＝0.999 5）。結果表明，纈沙坦和氫氯噻嗪檢測濃度線性范圍分別為8～160、1.25～25 μg·mL－1。

2.4 精密度試驗

取混合標準品溶液，重復進樣6次，得纈沙坦和氫氯噻嗪峰面積的RSD分別為0.35%、0.13%。

2.5 重復性試驗

取同批樣品，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果，纈沙坦和氫氯噻嗪含量的RSD分別為1.6%和1.1%。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液，4 ℃避光放置，于0、1、2、4、8 h分別進樣20 μL。結果，纈沙坦和氫氯噻嗪峰面積的RSD分別為0.76%和0.48%，表明供試品溶液在8 h內基本穩定。

2.7 回收率試驗

精密稱取同批已知含量的纈沙坦氫氯噻嗪膠囊的內容物，共9份，平均分為3組，分別按80%、100%、120%的量加入標準品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。按外標法計算纈沙坦、氫氯噻嗪的平均回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測定

分別精密稱取不同批號的樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜峰，按外標法以峰面積計算纈沙坦、氫氯噻嗪含量（占標示量），結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本品含量測定所用溶劑為流動相，因纈沙坦在此流動相中易溶；而氫氯噻嗪需超聲溶解，因此在含量測定中，制備標準品溶液與供試品溶液時均需要進行超聲處理。

3.2 檢測波長的選擇

本方法采用在230 nm波長處同時測定纈沙坦和氫氯噻嗪2種成分的含量，因為本品為復方制劑，同時測定兩者的含量可使質控方法更簡便。纈沙坦在230 nm波長附近有最大吸收，而氫氯噻嗪在較長波長范圍內（200～400 nm）都有較大的吸收，在230 nm波長處吸收亦較大，故采用230 nm作為二者的檢測波長。

3.3 流動相的選擇

筆者曾選用甲醇-水及乙腈-水為流動相，兩者分離度相近，但是采用前者時氫氯噻嗪拖尾因子比乙腈大，而當調整甲醇和水的比例并調節pH值后，既避免了氫氯噻嗪峰的拖尾現象，又使得樣品中各雜質峰能與纈沙坦、氫氯噻嗪峰有效分離。此外，色譜級的乙腈價格比色譜級甲醇的價格高很多，且毒性大。因此在保證分離效果的前提下，最終選定甲醇-水的流動相組成（70∶30，用磷酸調pH為3.1）用于本次分析。

3.4 方法的確定

目前國內生產此藥的生產廠家很少，對此藥的研究也非常少。國內未見有關纈沙坦氫氯噻嗪膠囊中氫氯噻嗪含量測定方法的文獻報道；有測定復方纈沙坦片中纈沙坦含量的文獻報道[8]，但是此方法不能很好地分離纈沙坦和氫氯噻嗪。本研究建立的HPLC-UV法能在同一種條件下同時測定出2種成分含量，既節省時間又可以保證測定的準確度和精密度，而且峰形良好，分離度、拖尾因子等也達到了要求。因此，本研究為纈沙坦氫氯噻嗪膠囊的質量控制提供了一種簡便且省時的方法。

國外通常采用HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）法同時測定2種成分的含量[9]，由于纈沙坦氫氯噻嗪膠囊中纈沙坦和氫氯噻嗪的含量相差較大，對檢測器的靈敏度要求較高，DAD檢測器的靈敏度比UV檢測器要低，所以，本研究建立的HPLCUV法靈敏度更高。

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