動態濁度法檢測乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中的細菌內毒素

李榮，吳玲（1.南華大學附屬第二醫院，湖南衡陽41001；.衡陽市藥品檢驗所，湖南衡陽41001）

乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（Levofloxacin lactate and sodium chloride injection，LSI）臨床應用廣泛，可對抗由敏感菌引起的呼吸系統、泌尿生殖系統、消化及皮膚軟組織等急、慢性感染。現行質量標準中熱原檢查采用經典的家兔法，而細菌內毒素法較家兔法快速、靈敏、準確、經濟。有報道[1]使用凝膠法檢測該藥的細菌內毒素，但此法為限量檢查法，不能準確測定樣品中的細菌內毒素含量，而定量法鱟試驗則可提供更靈敏而準確的細菌內毒素檢測方法。筆者采用檢測細菌內毒素的動態濁度法，對LSI進行添加細菌內毒素的回收試驗，并考察了干擾因素（檢測波長、pH值）對結果的影響，建立了LSI的細菌內毒素定量檢查法，為臨床安全用藥提供技術保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BET-32M細菌內毒素檢測儀（天津大學無線電廠）；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；PHS-3C型酸度計（衡陽市應用技術研究所）；ZH-2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；試管、反應試管、吸頭均經250℃烘烤2 h以上除熱原。

1.2 試藥

細菌內毒素檢查用水（BET水，批號:100404，規格:每支5 mL，內毒素含量＜0.005 EU·mL－1）、鱟試劑（批號:1003011，規格:每支0.6 mL，標示靈敏度λ＝0.03 EU·mL－1）均為湛江博康海洋生物有限公司產品；細菌內毒素工作標準品（CSE，中國食品藥品檢定研究院，批號:981，規格:每支9 000 EU）；LSI（浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號:101234、110113、110136，規格:300 mg·100 mL－1）。

2 方法與結果

2.1 LSI的細菌內毒素限值（L）的確定

按2010年版《中國藥典》規定[2]，L＝K/M，其中K為人用每kg體重每小時最大可接受的內毒素劑量，K＝5 EU/（kg·h）；M為每kg體重每小時最大供試品劑量，由于LSI靜脈滴注過快易引起靜脈刺激癥狀或中樞神經系統反應，故每小時人體最多可以接受的量為100 mL。人均體重按60 kg計算，則L＝3 EU·mL－1。此值明顯高于一般大容量輸液細菌內毒素限值0.5 EU·mL－1，考慮到藥品使用安全性要求及一般大容量輸液細菌內毒素限值要求，將本品的L定為0.5 EU·mL－1為宜。

2.2 標準曲線的可靠性試驗

用BET水對CSE進行稀釋，使其細菌內毒素最終濃度分別為2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1，各取0.15 mL分別加到預先加有0.15 mL鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入細菌內毒素檢測儀內進行檢測，每濃度平行3管；同時用BET水與鱟試劑反應作為陰性對照，平行3管，反應溫度為（37±1）℃，工作波長為450 nm，預設吸光度為0.02。結果見表1。

經整理得標準曲線回歸方程為lgT＝2.974 60－0.376 14 lgc（T為反應時間，c為溶液中細菌內毒素濃度），其相關系數r＝－0.998 8（絕對值應大于0.98），反應時間在710～347 2 s，而陰性對照管反應時間＞3 600 s，標準曲線最低細菌內毒素濃度點λ1＝0.031 25 EU·mL－1，陰性對照管在檢測時間外，因此標準曲線成立。

表1 標準曲線的可靠性試驗（n＝3）Tab 1 Reliability test of standard curve（n＝3）

2.3 樣品最大稀釋倍數（MVD）及干擾試驗

按照公式 MVD＝L/λ1，其中λ1為標準曲線的最低濃度0.031 25 EU·mL－1，計算得樣品試驗時MVD為16倍。將LSI用BET水依次稀釋為2、4、8、16倍，記為Ai液；同時另取4管，進行同樣倍數的稀釋，并在稀釋液中添加細菌內毒素濃度（λm）為0.25 EU·mL－1的細菌內毒素標準溶液，記為Bi液，進行回收試驗。分別取上述各液0.15 mL加到預先加有0.15 mL鱟試劑反應管內，混合均勻，插入細菌內毒素檢測儀內進行檢測，每濃度重復2管，檢測條件同“2.2”項下。測定結束后，按標準曲線回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準細菌內毒素λm的供試品溶液的細菌內毒素含量，計算回收率（Bi/0.25×100%），結果見表2。

表2 干擾試驗（n＝2）Tab 2 Interference test（n＝2）

由表2結果可見，LSI的2～16倍稀釋液回收率雖均在50%～200%范圍內，符合有關要求[2]，但由于2倍稀釋液的回收率接近50%，故在日常檢查中以其8倍（3 mg·mL－1/8＝0.375 mg·mL－1）稀釋液為好。

2.4 動態濁度法與凝膠法比較

取樣品8倍（0.375 mg·mL－1）稀釋液，按《中國藥典》2010年版二部動態濁度法與凝膠法[2]進行檢查，處理方法同“2.3”項下，檢測結果表明2種方法結果一致，均符合規定，詳見表3。

表3 動態濁度法與凝膠法檢測結果比較Tab 3 Comparison of the results of KTA and gel-clot test

2.5 消除干擾因素的試驗

2.5.1 對檢測光源（450 nm）的吸收試驗。將LSI（批號為101234）用BET水稀釋成下列濃度:2倍（1.5 mg·mL－1）、4倍（0.75 mg·mL－1）、8 倍（0.375 mg·mL－1）、16倍（0.187 5 mg·mL－1），用紫外分光光度計測定450 nm波長處吸光度，分別為:0.001、－0.002、0.001、－0.003。可見，LSI對檢測光源（450 nm）吸收很弱，隨著供試品的稀釋，吸光度的變化不大，故光源吸收不是主要的干擾因素。

2.5.2 pH值試驗。將LSI同“2.5.1”項下試驗方法系列稀釋后用酸度計測定pH值，結果分別為4.93（1.5 mg·mL－1）、4.87（0.75 mg·mL－1）、4.89（0.375 mg·mL－1）、4.96（0.187 5 mg·mL－1）。pH值接近6～8范圍，“除非有特殊的要求，否則在各論中樣品和鱟試劑在檢測混合物pH值范圍為6.0～8.0”[3]，由于鱟試劑本身具備一定的緩沖能力，故pH值也不是干擾動態濁度法的主要因素。

3 討論

LSI的4～16倍（0.75～0.187 5 mg·mL－1）稀釋液的回收率均在90%～200%范圍內，表明在此試驗條件下供試品溶液對鱟試劑不存在干擾作用。由于LSI供試品溶液對檢測光源的吸收很弱，pH值接近6～8范圍，且其采用動態濁度法與凝膠法檢查結果一致，所以認為LSI上述濃度稀釋液用動態濁度法進行細菌內毒素檢測是可行的。

動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。基于細菌內毒素與鱟試劑的反應是由于一系列酶促放大作用而產生的，故其干擾因素較多，主要包括供試品的酸堿度、金屬離子濃度、非特異性鱟試劑激活物、對儀器檢測光源（450 nm）的吸收干擾等。按照《中國藥典》2010版（二部）附錄指導原則[2]，一般采用稀釋法可消除這種干擾。

利用動態濁度法進行細菌內毒素定量檢測，具有操作簡便、結果準確、靈敏度高等優點。國外細菌內毒素定量法的使用率已超過凝膠法，約占65%～70%[4]。此法廣泛應用于小容量注射液與大輸液混合后的細菌內毒素檢查，對于臨床輸液質量的控制可提供科學有效的依據。

[1]李海英，王瓊芬.乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素檢查[J].中國藥業，2008，17（12）:55.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄ⅪE.

[3]United States Pharmacopeia Convention Inc.The United States Pharmacopeia[S].23rd.Easton:Easton Publishing Co.，1995:Appendix 1 969.

[4]李楚云，詹云麗.輸液熱原反應與細菌內毒素的定量研究[J].中國實用醫藥，2010，5（10）:230.