AP-4 在惡性腫瘤中的表達和意義

蘇 娜 烏日罕 孫秀威

哈爾濱醫科大學附屬第三醫院消化內科一病區(150040)

隨著人口的老齡化、人口數量的增長以及發展中國家不良生活方式的普及，全球惡性腫瘤負荷呈持續大幅上升趨勢。2008年全球惡性腫瘤新發病例約為1270 萬，死亡病例約為760 萬，其中56%和64%出現于發展中國家［1］。惡性腫瘤是以細胞增殖和轉移為特點的一大類疾病，其發生、發展與多基因、多因素的調節有關。激活蛋白4(activator protein 4，AP-4)作為轉錄因子AP 家族的一員，在多種惡性腫瘤中呈過表達，參與了惡性腫瘤細胞凋亡、增殖、血管生成、轉移、DNA 修復等的調節。本文就AP-4 的結構、作用途徑及其在惡性腫瘤中的表達和意義作一綜述。

一、AP 家族簡介

迄今已發現的AP 家族成員包括AP-1、-2、-3、-4、-5、-6，最早得到研究的轉錄因子AP-1 與細胞凋亡、增殖、分化、移行相關，并參與誘導血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達上調，從而促進腫瘤血管生成以及腫瘤的侵襲、轉移，在前列腺癌、結腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈過表達［2～5］。AP-2 亦參與細胞分化、增殖等生理過程，并在多種惡性腫瘤中呈過表達［6］。

二、AP-4 的結構

1988年Mermod 等［7］首次報道了AP-4，其作為猴病毒40(SV40)的轉錄增強子結合蛋白，可在體外激活SV40 病毒的晚期轉錄。AP-4 具有三個二聚體化功能域，分別為一個螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix，HLH)基序和兩個不同的亮氨酸重復元件LR1、LR2，HLH 及其毗鄰的堿性結構域對于AP-4 的序列特異性DNA 結合具有重要意義。活化的AP-4單體聚合，以同源二聚體的形式穿越核膜，識別并結合DNA上的特異性序列CAGCTG，以調控靶基因表達［8］。

三、AP-4 的作用途徑

AP-4 作為轉錄因子，通過識別和結合DNA 上的特異性序列CAGCTG 調控靶基因表達，參與惡性腫瘤細胞凋亡、增殖、血管生成、轉移、DNA 修復等的調節。

1.調節細胞凋亡和增殖

①c-myc-AP-4-p21 級聯:抑癌基因p21 編碼細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制因子，可由p53 以及其他多種抗增殖因子誘導表達，其表達缺失與惡性腫瘤的預后顯著相關。Ogawa 等［9］以免疫組化方法檢測了胃癌患者的p21 蛋白表達，發現腫瘤轉移者p21 表達缺失的頻率更高，p21 表達陽性者預后顯著優于p21 表達陰性者。多種人類惡性腫瘤中存在原癌基因c-myc 過表達，c-myc 通過對p21 的轉錄抑制促進細胞周期進展，使細胞維持于增殖狀態，而AP-4 參與了這一調控過程。Jung 等［10］的研究發現，在人乳腺癌細胞中，c-myc 通過AP-4 基因第一內含子的CACGTG 序列直接誘導AP-4 表達，AP-4 繼而通過結合p21 啟動子CAGCTG 序列直接抑制p21 表達，干擾p53 誘導的細胞凋亡;以RNA 干擾技術下調AP-4 表達后，p21 表達上調;在人角質形成細胞中，AP-4 可阻斷轉化生長因子-β(TGF-β)誘導的p21 表達;在原單核細胞的分化過程中，AP-4 可干擾p21 表達上調和細胞周期阻滯。該研究證實由c-myc 觸發的c-myc-AP-4-p21 級聯參與了細胞凋亡的調節。這一級聯同樣存在于結腸上皮細胞和結直腸癌細胞中。在人結腸隱窩中，AP-4 表達局限于隱窩基底部，該部位主要為未分化的增殖性干細胞和祖細胞，p21 表達缺失;而在以分化細胞為主的隱窩上部，AP-4 表達缺失，p21 表達上調。在原發性結直腸癌組織中，AP-4 呈強陽性表達，并與c-myc 表達呈正相關［10，11］。綜合上述研究發現，推測AP-4 在其他惡性腫瘤中亦可通過c-myc-AP-4-p21 級聯抑制腫瘤細胞凋亡，具體情況有待深入研究。

②AP-4 與caspase-9:凋亡基因caspase-9 為p53 的下游成分，參與線粒體介導的凋亡途徑，通過與活化的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)結合而被線粒體釋放的細胞色素C和dATP 激活，進而激活caspase-2、-3、-6、-7、-8、-10，誘導細胞凋亡。研究發現部分胃癌［12］以及對治療耐受的慢性髓細胞樣白血病［13］和頭頸部鱗癌［14］中，caspase-9 mRNA 或蛋白表達下調或活性降低，推測caspase-9 表達下調可能通過抑制細胞凋亡參與了惡性腫瘤的發生、發展和耐藥。然而Tsujimoto 等［15］在鑒定參與糖皮質激素誘導小鼠胸腺淋巴細胞凋亡的相關基因時，發現AP-4 在正常情況下可維持caspase-9 基礎水平的表達，然而一旦AP-4 表達超過某一特定水平，將不再對caspase-9 表達產生明顯影響。該現象的確切機制有待進一步研究，推測可能與其他轉錄因子的參與有關。

③AP-4 與E7 癌蛋白:16 型人乳頭狀瘤病毒(HPV16)產物E7 癌蛋白可與宿主細胞的抑癌蛋白pRb 結合而使之失活，造成宿主細胞凋亡和細胞周期紊亂，打破細胞正常增殖與凋亡之間的平衡，導致細胞過度增殖，發生惡性轉化。Glahder 等［16］的研究發現，E6 癌蛋白開放閱讀框中的P542是E7 癌蛋白單順反子mRNA 的轉錄啟動子，AP-4 可與其下游序列結合而抑制其活性，從而下調E7 癌蛋白表達，減低細胞凋亡和細胞周期紊亂的可能性。推測過量的AP-4 可能系通過與內源性激活轉錄因子競爭結合位點而抑制P542 啟動子活性。這一發現與其他研究中AP-4 呈現抗凋亡效應不同，提示AP-4 對細胞凋亡的調節作用可能是雙向的，具體機制有待進一步研究。

2.調節腫瘤血管生成和腫瘤轉移

①AP-4 與VEGF和MMP-9:VEGF 是一種重要的血管生成調節因子，可促進血管內皮細胞增殖、遷移、血管生成，增加血管通透性，抑制腫瘤細胞凋亡。目前研究發現VEGF 在多種惡性腫瘤中呈過表達。MMP-9 又稱Ⅳ型膠原酶，可通過降解作為基底膜中其他組分構建支架的Ⅳ型膠原和其他膠原成分促進腫瘤細胞對周圍組織的浸潤，在腫瘤浸潤、轉移、血管生成中發揮重要作用。與AP-1 一樣，AP-4 亦可調節VEGF和MMP-9 表達。VEGF 基因的3'-非翻譯區存在AP-4 結合位點CAGCTG，推測AP-4 可能通過與該位點結合激活VEGF 基因轉錄，促進腫瘤血管生成。Cao 等［17］的研究顯示，AP-4 蛋白表達與進展期結直腸癌的VEGF、MMP-9 mRNA 表達相關，AP-4 表達陽性的結直腸癌組織VEGF、MMP-9 mRNA 表達水平顯著高于AP-4 表達陰性者。上述發現證實AP-4 在激活VEGF、MMP-9 基因轉錄、促進兩者表達上調中起重要作用。

②AP-4 與蛋白酶激活受體4(PAR4):凝血酶受體PAR4是一類含7個跨膜區的G 蛋白偶聯受體，研究顯示凝血酶可通過PAR4 影響腫瘤的轉移。AP-4 為PAR4 的特異性激動劑，可激活PAR4 轉錄。Gratio 等［18］的研究發現，以AP-4刺激人結腸癌細胞，細胞內鈣離子濃度迅速升高，細胞促有絲分裂反應呈劑量依賴性增強，Src和ErbB-2 激酶參與了PAR4 異常表達促進結腸癌細胞增殖的信號轉導通路。

3.參與調節DNA 損傷修復:8-oxoG(8-oxo-2'deoxyguanosine)是目前研究最多的DNA 氧化損傷，此種損傷具有致突變性，與腫瘤的發生、發展密切相關［19］。OGG1(8-oxoGDNA glycosylase)是能特異性識別8-oxoG 并將其切除的DNA修復酶，OGG1 基因突變或缺失可致細胞修復8-oxoG 的能力降低或缺失，導致惡性腫瘤的發生。Habib 等［20］發現人腎上皮細胞中AP4 與OGG1 蛋白表達呈正相關，以RNA 干擾技術下調AP-4 表達后，OGG1 蛋白表達顯著減低;凝膠移位分析和染色質免疫沉淀技術證實AP-4 為OGG1 基因啟動子的正向調節因子。據此推測，AP-4 表達下調時，OGG1 將不能維持正常表達水平，從而參與惡性腫瘤的發生。這一發現與既往認為AP-4 促進惡性腫瘤發生的觀點不符，表明AP-4 在惡性腫瘤發生中的作用具有多樣性。

4.刺激細胞增殖、分化:胰島素樣生長因子結合蛋白-2(IGFBP-2)為多種惡性腫瘤的誘導蛋白。Badinga 等［21］對人肝癌細胞IGFBP-2 基因的5'-側翼區進行功能分析以鑒別介導該基因轉錄的核因子，發現其轉錄激活區位于-874 bp 與-765 bp之間，其中含有AP-4 結合位點CACCTG。AP-4 可與此位點結合，誘導IGFBP-2 基因轉錄和蛋白合成，影響肝癌細胞的增殖、分化。

四、AP-4 在惡性腫瘤中的研究

1.胃癌:研究證實AP-4 可下調p21 表達，通過c-myc-AP-4-p21 級聯抑制腫瘤細胞凋亡［10，11］，而p21 表達缺失與胃癌患者預后不良相關［9］，因此推測AP-4 可能與胃癌預后有關。劉興華等［22］以免疫組化方法和實時PCR 檢測了AP-4 在胃癌和癌旁正常組織中的表達，發現其在癌旁正常組織中表達于上皮細胞的細胞核，在胃癌組織中則呈彌漫性表達，胃癌組織AP-4 蛋白陽性表達率和AP-4 mRNA 相對表達量均顯著高于癌旁正常組織，其中mRNA 相對表達量高達癌旁正常組織的4.82 倍。該研究還發現AP-4 表達與胃癌浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、TNM 分期呈正相關，AP-4過表達與患者預后不良相關，AP-4 表達陽性者中位生存期顯著短于AP-4 表達陰性者(12.60個月對41.40個月)。上述發現表明AP-4 基因可能作為癌基因參與了胃癌的發生、發展，AP-4 可作為預測胃癌進展和預后的分子標記物。該學者的相關研究［23］還發現，以RNA 干擾技術下調人胃癌細胞株AGS 的AP-4 表達，AGS 細胞增殖顯著受抑，對化療藥物如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑、阿霉素的敏感性顯著增強，這一發現為胃癌的基因靶向治療研究提供了新的線索。

2.結直腸癌:Jung 等［10，11］發現結直腸癌中存在抑制腫瘤細胞凋亡的c-myc-AP-4-p21 級聯，因此推測AP-4 可能與結直腸癌的發生、發展和預后有關。Cao 等［17］應用組織芯片免疫組化染色和實時RT-PCR 比較了AP-4 在正常結直腸組織、結直腸腺瘤和腺癌組織中的表達情況，發現其蛋白陽性表達率在三種組織中依次上調(4/32、8/32和78/160)，AP-4 表達與結直腸腺癌的腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移和預后不良相關。該作者的另一項研究［24］發現，以RNA 干擾技術下調人結腸癌細胞株SW480 的AP-4 表達能有效抑制細胞的生長、增殖和體外侵襲能力，并能誘導細胞凋亡，這一發現為以AP-4 為靶點的結直腸癌基因治療提供了新的思路。

3.前列腺癌:L-plastin 是人肌動蛋白結合蛋白家族成員之一，其在前列腺癌中的過表達可能與腫瘤細胞的遷移、侵襲相關。L-plastin 表達的調控包括甾類激素途徑和非甾類激素途徑兩種。林天歆等［25］對前列腺癌中L-plastin 表達的非甾類激素調控位點進行了研究，發現在L-plastin 啟動子的-198～-192 之間存在一個AP-4 結合位點，吻合程度達91%，推測AP-4 可能是調控前列腺癌中L-plastin 表達的非甾類激素途徑之一，參與了晚期前列腺癌對激素治療產生耐受的發生機制。

4.乳腺癌:Buechler［26］的研究表明，在雌激素受體陽性的乳腺癌患者中，AP-4 表達陰性者無進展生存期顯著長于AP-4 表達陽性者，表明AP-4 有望成為一個新的乳腺癌獨立預后指標。

Amin 等［27］的研究發現，在人乳腺癌細胞株MCF-7 中，JNK MAPK 信號通路激活可抑制腫瘤細胞增殖。進一步研究JNK 激活在乳腺癌細胞中誘導抗增殖信號的分子機制，發現其可誘導轉錄因子AP-4和RFX-1 與上皮組織特異性SHP1 啟動子結合，通過誘導SHP1 表達而抑制癌細胞增殖，SHP1 對血清或胰島素樣生長因子-1(IGF-1)刺激引起的乳腺癌細胞增殖具有明顯負向調控作用。這一發現提示AP-4在乳腺癌中的作用具有多樣性。

五、結語

轉錄因子AP-4 在惡性腫瘤中的研究已取得一些進展，目前研究結果表明AP-4 在惡性腫瘤發生、發展中所起的作用是多樣性的，而并非單一促進或抑制作用，其作用機制復雜，以促進作用為主。關于AP-4 在不同惡性腫瘤中的表達情況、調控機制及其與腫瘤臨床病理特征和預后的關系仍有待深入研究，反復驗證。AP-4 有望成為預測多種惡性腫瘤進展和預后的分子標記物，并可能為惡性腫瘤的基因治療開辟一條新的途徑。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61 (2):69-90.

2 Kajanne R，Miettinen P，Tenhunen M，et al.Transcription factor AP-1 promotes growth and radioresistance in prostate cancer cells［J］.Int J Oncol，2009，35 (5):1175-1182.

3 Vaiopoulos AG，Papachroni KK，Papavassiliou AG.Colon carcinogenesis:Learning from NF-kappaB and AP-1［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42 (7):1061-1065.

4 Yin Y，Wang S，Sun Y，et al.JNK/AP-1 pathway is involved in tumor necrosis factor-alpha induced expression of vascular endothelial growth factor in MCF7 cells［J］.Biomed Pharmacother，2009，63 (6):429-435.

5 Chandrasekar B，Mummidi S，Mahimainathan L，et al.Interleukin-18-induced human coronary artery smooth muscle cell migration is dependent on NF-kappaB-and AP-1-mediated matrix metalloproteinase-9 expression and is inhibited by atorvastatin［J］.J Biol Chem，2006，281(22):15099-15109.

6 Eckert D，Buhl S，Weber S，et al.The AP-2 family of transcription factors［J］.Genome Biol，2005，6 (13):246.

7 Mermod N，Williams TJ，Tjian R.Enhancer binding factors AP-4 and AP-1 act in concert to activate SV40 late transcription in vitro［J］.Nature，1988，332 (6164):557-561.

8 Hu YF，Lüscher B，Admon A，et al.Transcription factor AP-4 contains multiple dimerization domains that regulate dimer specificity［J］.Genes Dev，1990，4 (10):1741-1752.

9 Ogawa M，Maeda K，Onoda N，et al.Immunohistochemical study of p21 expression in gastric carcinoma (Article in Japanese)［J］.Gan To Kagaku Ryoho，1997，24 Suppl 2:292-295.

10 Jung P，Menssen A，Mayr D，et al.AP4 encodes a c-MYC-inducible repressor of p21［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105 (39):15046-15051.

11 Jung P，Hermeking H.The c-MYC-AP4-p21 cascade［J］.Cell Cycle，2009，8 (7):982-989.

12 方長清，劉樹立，婁毅，等.胃癌組織中caspase 9 的表達及其多態性變化［J］.世界華人消化雜志，2007，15(30):3190-3193.

13 Frank O，Brors B，Fabarius A，et al.Gene expression signature of primary imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patients［J］.Leukemia，2006，20 (8):1400-1407.

14 Kuwahara D，Tsutsumi K，Oyake D，et al.Inhibition of caspase-9 activity and Apaf-1 expression in cisplatinresistant head and neck squamous cell carcinoma cells［J］.Auris Nasus Larynx，2003，30 Suppl:S85-S88.

15 Tsujimoto K，Ono T，Sato M，et al.Regulation of the expression of caspase-9 by the transcription factor activator protein-4 in glucocorticoid-induced apoptosis［J］.J Biol Chem，2005，280 (30):27638-27644.

16 Glahder JA，Hansen CN，Vinther J，et al.A promoter within the E6 ORF of human papillomavirus type 16 contributes to the expression of the E7 oncoprotein from a monocistronic mRNA［J］.J Gen Virol，2003，84 (Pt 12):3429-3441.

17 Cao J，Tang M，Li WL，et al.Upregulation of activator protein-4 in human colorectal cancer with metastasis［J］.Int J Surg Pathol，2009，17 (1):16-21.

18 Gratio V，Walker F，Lehy T，et al.Aberrant expression of proteinase-activated receptor 4 promotes colon cancer cell proliferation through a persistent signaling that involves Src and ErbB-2 kinase［J］.Int J Cancer，2009，124 (7):1517-1525.

19 Cooke MS，Evans MD，Dizdaroglu M，et al.Oxidative DNA damage:mechanisms，mutation，and disease［J］.FASEB J，2003，17 (10):1195-1214.

20 Habib SL，Bhandari BK，Sadek N，et al.Novel mechanism of regulation of the DNA repair enzyme OGG1 in tuberindeficient cells［J］.Carcinogenesis，2010，31 (11):2022-2030.

21 Badinga L，Song S，Simmen RC，et al.A distal regulatory region of the insulin-like growth factor binding protein-2(IGFBP-2)gene interacts with the basic helix-loop-helix transcription factor，AP-4［J］.Endocrine，1998，8 (3):281-289.

22 Xinghua L，Bo Z，Yan G，et al.The overexpression of AP-4 as a prognostic indicator for gastric carcinoma［J］.Med Oncol，2012，29 (2):871-877.

23 劉興華.轉錄因子AP-4 在胃癌中的表達及其腫瘤生物學功能和機制的研究［D］.武漢:華中科技大學，2011.

24 曹杰，譚明華，王輝，等.RNA 干擾轉錄因子激活蛋白4基因表達對結腸癌細胞株SW480 的影響［J］.中華胃腸外科雜志，2007，10 (6):574-578.

25 林天歆，黃健，黃海，等.前列腺癌中L-plastin 啟動子的非甾體激素類順式作用元件的鑒定［J］.中華男科學雜志，2005，11 (10):731-734.

26 Buechler S.Low expression of a few genes indicates good prognosis in estrogen receptor positive breast cancer［J］.BMC Cancer，2009，9:243.

27 Amin S，Kumar A，Nilchi L，et al.Breast cancer cells proliferation is regulated by tyrosine phosphatase SHP1 through c-jun N-terminal kinase and cooperative induction of RFX-1 and AP-4 transcription factors［J］.Mol Cancer Res，2011，9 (8):1112-1125.