基于數字全息的活體細胞動態相襯顯微觀察

劉 爍 潘 鋒 肖 文

(北京航空航天大學 儀器科學與光電工程學院，北京 100191)

數字全息技術采用CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor)等數字相機記錄干涉圖譜，并通過數值再現來還原物光場分布，近年來其應用領域已得到了廣泛拓展［1－3］.結合數字全息和光學顯微原理而發展出來的數字全息顯微術，已經用于還原和分析MEMS(Micro-Electro-Mechanical Systems)、生物細胞等微小物體的三維形態特征［4－6］.數字全息顯微術可同時獲得物光場的振幅和相位信息，且具有非接觸、非破壞、無標記、高分辨率的優勢，因而非常適用于生物樣品特別是活體組織和細胞的顯微觀察和定量分析，已成為數字全息應用研究中的熱點［7－9］.

為了研究生命機理和分析某些特殊的生物效應，活體細胞的培養和觀察多需在較復雜條件下完成，如在載人空間站的微重力環境下對生物細胞進行觀測實驗.與原子力顯微術、共聚焦熒光顯微術等相比，數字全息顯微術對實驗環境和樣品制備的要求相對較低，可在無損條件下進行動態定量分析.為更好地適應生物活體細胞的觀測需求，本文搭建了一套預放大離軸數字全息顯微實驗系統，利用單模光纖和光纖器件優化了光路結構，采用無窮遠校正顯微物鏡提高了成像分辨率，并引入曲率匹配透鏡對相位畸變進行了初步補償.在數值再現過程中，通過構造數字掩模對相位畸變進行了進一步的校正.對在恒溫條件下培養的小鼠活體骨細胞樣品進行了連續的動態觀察，得到了細胞的高分辨率相襯圖像，觀測到了細胞生長過程中的形態變化，驗證了實驗系統和方法的有效性.

1 數字全息顯微原理

數字全息顯微術是在數字全息原理基礎上通過提升觀測分辨率實現的，主要實現方法包括合成孔徑法［6］、顯微物鏡預放大法［7］、無透鏡傅里葉變換法［9］等.其中顯微物鏡預放大法的分辨率提升效果最為直接.結合離軸全息記錄，此方法可利用單幅全息圖得到物光場的振幅和相位分布，因而更適用于動態觀察.

數字全息顯微術的實現過程分為干涉記錄和數值再現兩步，其記錄光路有透射式和反射式兩種.生物活體細胞多為半透明狀態，其觀察一般采用透射式光路.圖1是本文采用的透射式預放大離軸數字全息顯微的記錄光路原理示意圖.一束照明光首先經過待測樣品S透射，其強度變化反映了樣品的透射率分布，其光程變化則反映了樣品的形貌和折射率分布.透射光經過無窮遠校正顯微物鏡MO和中繼成像透鏡TL后完成預放大，形成物光O.物光O經合光棱鏡BS與參考光R相干疊加，干涉圖譜被CMOS捕獲，形成數字全息圖.工作中，樣品S置于MO的前焦面處，可在TL的后焦面處形成樣品的放大實像I，此實像相當于全息記錄的實際目標物，觀測分辨率由此得以提升.為抑制全息中的零級像和共軛像干擾問題［10］，相干疊加時O和R在傳播方向上需要存在一個合適的夾角，構成離軸數字全息記錄結構.

圖1 透射式預放大離軸數字全息顯微記錄原理

干涉記錄完成后，待測樣品的光學特征信息已經包含在CMOS捕獲的數字全息圖中.在數值再現過程，通過對全息圖進行數值處理和解算，可以得到物光場在放大實像平面的復振幅分布，進而還原樣品的細節信息.

2 實驗裝置搭建

傳統的數字全息顯微系統多通過分立光學元件直接搭建，系統結構比較松散，靈活性和穩定性也較低.為適應生物活體細胞的動態觀測特點，通過引入單模光纖和光纖器件對數字全息顯微系統進行了優化，系統的基本結構如圖2所示.系統采用馬赫-曾德干涉儀結構，利用倍頻Nd:YAG固體激光器(532nm，50mW)作為相干光源L，出射的激光經光纖耦合器LFC進入單模光纖OF，而后經3 dB光纖分束器FS分為兩路.一路經光纖準直鏡FC出射作為照明光，經待測樣品S透射后，利用無窮遠校正顯微物鏡MO(20×，NA=0.4)和中繼成像透鏡TL完成預放大，形成物光O.另一路從光纖頭出射后形成球面光，經曲率匹配透鏡CL調整后形成參考光R.O和R經合光棱鏡BS實現相干疊加，形成數字全息圖，并被CMOS捕獲記錄.通過調節參考光路光纖出射端的角度，可以改變物光和參考光的夾角θ，保證離軸數字全息記錄的實現.通過調整CL的位置，可以使R和O的曲率比較接近，對MO和TL導致的相位彎曲進行初步補償.

圖2 生物活體細胞動態觀測的數字全息顯微裝置

此系統利用單模光纖和光纖器件完成了照明光和參考光的傳導和分光，系統結構緊湊，質量和體積較小，器件布局更為靈活，實驗調整的難度也得以降低，從而適用于較復雜條件下活體細胞的動態顯微觀察.

3 數值再現和相位還原

利用實驗系統獲取的數字全息圖，通過數值算法進行解算，可再現還原物光場信息.數字全息圖H在CMOS記錄面獲取，可以表示為

其中，O和R分別表示物光和參考光在CMOS記錄平面的復振幅分布;*表示復共軛.在全息理論中，式(1)的最后一項對應于虛像，物光場可通過此項還原.其他3項為干擾項，對應于零級像和共軛像，根據離軸數字全息原理，這3項可以通過傅里葉頻域濾波濾除［11］.為校正離軸相位傾斜并進一步補償顯微物鏡引入的相位彎曲［12］，構造了數字相位掩模M，并將其與濾波后的全息圖相乘.進而利用卷積再現算法［11］，得到放大實像所在平面的物光復振幅分布Ψ:

其中，DFT和DFT－1分別表示離散傅里葉變換和其逆變換;filter表示傅里葉頻域濾波;g表示空間脈沖響應函數.最后，由Ψ計算得到振幅圖A和相位圖φ:

其中，ΨRe和ΨIm分別表示Ψ的實部和虛部.振幅圖A和相位圖φ分別反映了樣品的透射率分布和樣品引入的光程變化.對于近似透明的活體細胞來說，振幅圖能夠反映的信息較少，而相位圖則可以用于分析細胞的形態和折射率分布，即相襯顯微圖.經二維相位解包裹后，相位圖φ即可用于定量分析.

4 小鼠活體骨細胞動態觀察和分析

為驗證實驗系統和再現方法的有效性，對小鼠活體骨細胞樣品進行了連續的動態相襯顯微觀察.將預先培養的小鼠骨細胞MLO-Y4活體樣品接種在35mm培養皿中，利用圖2所示的實驗系統進行動態觀察.為保證活體細胞樣品在37℃的恒溫環境下生長，物光光路周圍配備了一個半封閉的圓柱形熱水循環設備，培養皿、光纖準直鏡和顯微物鏡都放置于此設備中心的空腔里.實驗中所用CMOS相機的分辨率為1024×1024，像素大小為6.7μm ×6.7μm，拍攝獲取全息圖的曝光時間約為10ms.采用定時拍攝功能，每隔1min獲取一幅數字全息圖，連續觀察了8 h，共得到480幅全息圖.利用之前所述的數值再現方法進行解算，即可得到反映活體細胞生長變化的顯微圖像.圖3a是獲取的第一幅數字全息圖，圖3b和圖3c分別為利用此幅全息圖再現得到的振幅圖和相位圖.由于活體細胞近似透明且沒有經過染色處理，振幅圖中細胞的輪廓和形態特征并不明顯，而相位圖則較為清晰地反映了細胞引入的光程變化和形貌特征.視場中存在很多細胞，每個細胞都可以進行獨立的動態分析.圖4中顯示了圖3c虛線框內的細胞在觀察開始后0，40和80min 3個不同時刻的相襯顯微圖.從圖中可以看出，隨著時間的推移，此細胞發生了明顯的運動和形態變化.實驗中利用20×顯微物鏡進行預放大，成像分辨率達到了微米量級.

圖3 小鼠活體骨細胞樣品的數字全息顯微觀察實驗結果

圖4 小鼠活體骨細胞樣品在不同時刻的相襯顯微圖像

5 結論

數字全息顯微術提供了一種無損、無標記的高分辨率定量相襯顯微方法.利用單模光纖和光纖器件可以優化數字全息顯微裝置的光路結構，增強緊湊性和靈活性.采用曲率匹配透鏡和數字相位掩模相結合的方法，可以對相位畸變進行有效校正.小鼠活體骨細胞的實驗結果表明，數字全息顯微術可以動態獲得高分辨率的活體細胞相襯顯微圖像，從而用于分析細胞的生長變化和運動過程.通過對實驗裝置和再現算法進行進一步優化，數字全息顯微術將可以更為廣泛地應用于生物活體組織和細胞的動態觀察，從而促進對生物過程的理解，推動生命科學研究的發展.

References)

［1］ Schnars U，Jüptner W.Direct recording of holograms by a CCD target and numerical reconstruction ［J］.Applied Optics，1994，33(2):179－181

［2］ Hossain M M，Shakher C.Temperature measurement in laminar free convective flow using digital holography［J］.Applied Optics，2009，48(10):1869 －1877

［3］ Ferraro P，Grilli S，Alfieri D，et al.Extended focused image in microscopy by digital holography ［J］.Opt Express，2005，13(18):6738－6749

［4］ Cuche E，Marquet P，Depeursinge C.Simultaneous amplitude contrast and quantitative phase contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off axis holograms［J］.Applied Optics，1999，38(34):6994 －7001

［5］ Dubois F，Callens N，Yourassowsky C，et al.Digital holographic microscopy with reduced spatial coherence for three-dimensional particle flow analysis［J］.Applied Optics，2006，45(5):864 －871

［6］ Pan Feng，Xiao Wen，Rong Lu.Long-working-distance synthetic aperture Fresnel off-axis digital holography ［J］.Opt Express，2009，17(7):5473 －5480

［7］ Rappaz B，Marquet P，Cuche E，et al.Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cells with digital holographic microscopy ［J］.Opt Express，2005，13(23):9361－9373

［8］ Kemper B，Carl D，Schnekenburger J，et al.Investigation of living pancreas tumor cells by digital holographic microscopy［J］.J Biomed Opt，2006，11(3):034005-1 －6

［9］趙潔，王大勇，李艷，等.數字全息顯微術應用于生物樣品相襯成像的實驗研究［J］.中國激光，2010，37(11):2906－2911 Zhao Jie，Wang Dayong，Li Yan，et al.Experimental study on the quantitative phase contrast imaging of the biological samples by digital holographic microscopy ［J］.Chinese Journal of Lasers，2010，37(11):2906 －2911(in Chinese)

［10］ Kreis T.Handbook of holographic interferometry［M］.Weinheim:Wiley-VCH，2005

［11］ Cuche E，Marquet P，Depeursinge C.Spatial filtering for zero order and twin-image elimination in digital off-axis holography［J］.Applied Optics，2000，39(23):4070 － 4075

［12］ Colomb T，Cuche E，Charrière F，et al.Automatic procedure for aberration compensation in digital holographic microscopy and applications to specimen shape compensation ［J］.Applied Optics，2006，45(5):851 －863