鹽酸頭孢替安酯的聚合物檢查方法的建立與驗(yàn)證

褚 良，張 哲

(遼寧省盤錦市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧盤錦124010)

鹽酸頭孢替安酯(Cefotiam hexetil hydrochloride)為半合成第2代口服頭孢菌素類廣譜抗生素頭孢替安的酯化物，最早由日本武田藥業(yè)研制成功并上市。本品自身并無(wú)抗菌作用，口服后在腸道粘膜迅速水解為頭孢替安(CTM)被吸收而起效，因此其有效成分為頭孢替安。頭孢替安對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性菌的抗菌活性與以往口服的頭孢菌素相同，而且對(duì)β－內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。鹽酸頭孢替安酯可用于對(duì)本品敏感的葡萄球菌、肺炎球菌、嗜血流感桿菌所引起的咽喉炎、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、毛囊炎、淋巴節(jié)炎、乳腺炎、中耳炎等［1－3］。鹽酸頭孢替安酯不良反應(yīng)發(fā)生率約為3.6%，主要有腹瀉或軟便、嘔吐、腹痛、皮疹等。其屬于β－內(nèi)酰胺類抗生素，大量實(shí)驗(yàn)和研究表明，β－內(nèi)酰胺類抗生素引起的速發(fā)型過敏反應(yīng)與其含有的聚合物有關(guān)(有些還與藥物的毒性反應(yīng)有關(guān)［4］)。所以控制產(chǎn)品中聚合物含量是減少此類抗生素過敏反應(yīng)的重要途徑之一［5］。目前β－內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物的分析，主要是采用以葡聚糖凝膠G－10為天亮的凝膠色譜法［6－7］，但在日常實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)G－10凝膠色譜柱存在柱效低、分離效果差等缺點(diǎn)［8］。且G－10凝膠色譜柱只能用水系統(tǒng)作為流動(dòng)性，不能加入任何有機(jī)溶劑，對(duì)于一些不易溶于水的酯類抗生素?zé)o法進(jìn)行分析。近年來(lái)高效分子排阻色譜(HPSEC)法逐漸成熟，并用于分析抗生素中的聚合物含量［9］，該方法更為準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便易行，且其可以使用一定比例的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)性，因此應(yīng)用范圍更廣，是凝膠色譜發(fā)展的必然趨勢(shì)。本文參考了相關(guān)文獻(xiàn)，通過方法學(xué)驗(yàn)證，建立了使用凝膠色譜柱(TSD G2500 PWxl)的HPSEC發(fā)分析鹽酸頭孢替安酯的聚合物，對(duì)此方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，并采用驗(yàn)證后的方法對(duì)鹽酸頭孢替安酯進(jìn)行了檢驗(yàn)，此方法檢驗(yàn)鹽酸頭孢替安酯的聚合物可行。

1 儀器和試藥

1.1 儀器:島津2010A高效液相色譜儀

1.2 試藥:鹽酸頭孢替安酯對(duì)照品(廠家提供);供試品為某藥業(yè)提供的3批鹽酸頭孢替安酯(批號(hào)分別為:T111001，T111002，T111003);乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱為TSK G2500 PWxl凝膠柱(7.8 mm ×30 cm)(TOSOH Japan);流動(dòng)相:pH7.0 的0.001 mol/L 磷酸鹽緩沖液［0.001 mol/L的磷酸氫二鈉溶液－0.001 mol/L的磷酸二氫鈉溶液(61∶39)］一乙睛(80∶20);流速0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為:254 nm;進(jìn)樣量為20 uL。取對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次峰面積的相對(duì)偏差應(yīng)小于2%。

2.2 對(duì)照品溶液的制備:取鹽酸頭孢替安酯對(duì)照品適量，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL中約含10 μg頭孢替安的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備:取鹽酸頭孢替安酯樣品適量，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動(dòng)相定量稀釋制成每1 mL中約含1 mg頭孢替安的溶液，作為樣品溶液。

2.4 測(cè)定法:精密量取新配制的樣品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另精密量取對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。將鹽酸頭孢替安酯前的雜質(zhì)峰計(jì)為聚合物峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含鹽酸頭孢替安酯聚合物以頭孢替安計(jì)。

3 方法學(xué)考察

3.1 對(duì)照品線性關(guān)系:精密稱取鹽酸頭孢替安酯對(duì)照品30.13 mg，用乙腈溶解后分別加流動(dòng)性稀釋制成含頭孢替安1.03 μg/mL、5.15 μg/mL、10.30 μg/mL、15.45 μg/mL、20.60 μg/mL的溶液，分別精密量取上述溶液各20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。峰面積分別為:1297、6341、12382、19139、25842。以頭孢替安的濃度對(duì)峰面積作線性回歸，得回歸方程為:Y=1552.2X －158.01，r=0.9998。結(jié)果表明:進(jìn)樣濃度在1.03 μg/mL ～20.60 μg/mL 范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 對(duì)照品重復(fù)性

3.2.1 對(duì)照品溶液主峰的重復(fù)性:照“2.2”項(xiàng)下方法，取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，主峰面積分別為13765、13748、13692、13729、13801、13867.RSD=0.44%。重復(fù)性良好，可滿足檢驗(yàn)要求。

3.2.2 對(duì)照品溶液F值測(cè)定重復(fù)性:精密稱取鹽酸頭孢替安酯對(duì)照品約30 mg，共6份，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動(dòng)性定量稀釋制成每1 mL中含頭孢替安10 μg的溶液，分別精密量取6份對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。峰面積(A)與對(duì)照品稱樣量(W)的比值(校正因子F)有良好的重復(fù)性(見表1)，符合檢驗(yàn)要求。

表1 對(duì)照品溶液校正因子日內(nèi)重復(fù)性

3.3 對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性:照“2.2”項(xiàng)下方法，取對(duì)照品溶液，室溫放置 8 h，分別于 0、1、2、4、8 h 精密量取對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。主峰峰面積分別為13865、13816、13901、13787、13791，RSD=0.36%。對(duì)照品溶液室溫8 h內(nèi)穩(wěn)定，可滿足檢驗(yàn)要求。

3.4 聚合物線性關(guān)系:分別精密稱取樣品適量(批號(hào):T111001)置量瓶中，用少量乙腈溶解后加流動(dòng)性分別稀釋制成每 1 mL 含頭孢替安 0.10 mg、0.52 mg、1.03 mg、1.55 mg、2.06 mg的溶液，分別精密量取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。聚合物峰面積分別為:337、1798、3451、5103、6933。以頭孢替安的濃度對(duì)聚合物峰面積作線性回歸，得回歸方程為:Y=3334.6X+19.913，r=0.9998。結(jié)果表明:進(jìn)樣濃度在0.10 mg/mL～2.06 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與聚合物峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.5 聚合物峰F值測(cè)定重復(fù)性:精密稱取鹽酸頭孢替安酯樣品(批號(hào):T111001)約30 mg，共6份，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動(dòng)性定量稀釋制成每1 mL中含頭孢替安1 mg的溶液，分別精密量取6份樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。聚合物峰面積(A)與樣品稱樣量(W)的比值(校正因子F)有良好的重復(fù)性(見表2)，符合檢驗(yàn)要求。

表2 聚合物峰F值測(cè)定重復(fù)性

3.6 樣品溶液的穩(wěn)定性:照“2.3”項(xiàng)下方法，取樣品溶液，室溫放置 8 h，分別于 0、1、2、4、8 h 精密量取樣品溶液 20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。聚合物峰面積分別為3398、3584、3794、4077、5218，RSD=17.90%。樣品溶液室溫 8 h內(nèi)不穩(wěn)定，聚合物增加，因此樣品溶液應(yīng)臨用新制。

3.7 鹽酸頭孢替安酯定量限:以信噪比10∶1為指標(biāo)，測(cè)得顏色頭孢替安酯的定量限以頭孢替安計(jì)為0.66×10－5mg/mL。3.8 樣品聚合物的測(cè)定:照“2”項(xiàng)下方法測(cè)定3批樣品(批號(hào)分別為:T111001，T111002，T111003)聚合物的含量分別為0.21%，0.20%及 0.23%。

4 討論

4.1 色譜柱的選擇:建立上述測(cè)定方法時(shí)，同時(shí)考慮了Sephadex G－10和TSK G2500 PWxl兩種色譜柱。本品為酯類化合物，在水中溶解時(shí)形成膠狀體，不能完全溶解在水中，再向其中加入大量磷酸鹽緩沖液時(shí)形成絮狀的沉淀，但溶液中如果有一定比例的有機(jī)溶劑存在時(shí)就不會(huì)發(fā)生上述情況。由于Sephadex G－10色譜柱只能用水系統(tǒng)作為流動(dòng)性，不能用有機(jī)溶劑，而上述形態(tài)的樣品進(jìn)到色譜柱中只能使色譜柱阻塞，無(wú)法進(jìn)行樣品分析，因此無(wú)法使用Sephadex G－10。而TSK G2500 PWxl色譜柱可用一定比例的有機(jī)溶劑，因此樣品可以很好的分散在溶劑中，可以進(jìn)行樣品分析。同時(shí)TSK G2500 PWxl柱分離的分子量范圍廣，柱效高，分析時(shí)間短，能在高效液相色譜儀上使樣品與聚合物實(shí)現(xiàn)良好的分離，分離度大于1.5，且峰形對(duì)稱，因此選擇了 TSK G2500 PWxl柱進(jìn)行本品聚合物的分離檢測(cè)。

4.2 流動(dòng)性的離子強(qiáng)度、pH值及流速的選擇:流動(dòng)性的離子強(qiáng)度、pH值及流速可以影響樣品中聚合物與主峰的分離度。同時(shí)考慮到樣品在緩沖鹽系統(tǒng)中的溶解性。最終選擇流動(dòng)性的鹽濃度為 0.001 mol/L、pH 值為 7.0、流速為0.5 mL/min。

4.3 有機(jī)相比例的選擇:由于鹽酸頭孢替安酯的高分子雜質(zhì)分子量大小不一，且流動(dòng)相中不含有機(jī)相時(shí)樣品溶解度不好。但加入一定量的有機(jī)相后可改善樣品溶解度同時(shí)聚合物共流出形成單個(gè)色譜峰。分別將流動(dòng)相中0.005 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液和乙睛的比例設(shè)為70∶30、80∶20和90∶10進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:當(dāng)流動(dòng)相比例為90∶10時(shí)聚合物可見多個(gè)色譜峰，當(dāng)有機(jī)相比例增大為80∶20及70∶30時(shí)聚合物共流出形成單個(gè)色譜峰，頭孢替安酯與其聚合物實(shí)現(xiàn)有效分離。但由于有機(jī)相比例大時(shí)可能會(huì)縮短色譜柱的使用壽命，同時(shí)為了方便分析定量，因此選擇有機(jī)相比例為80∶20。

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