長鏈n－3多不飽和脂肪酸對腸上皮細胞促炎細胞因子基因mRNA表達的影響

黃志清 陳小玲 陳代文 余 冰 何 軍

（四川農業大學動物營養研究所，動物抗病營養教育部重點實驗室，雅安625014）

機體受到病原微生物感染時，促炎細胞因子的適量分泌對機體抵抗感染是有利的，但過量分泌則會對機體產生損傷。能否通過營養調控的手段來減少促炎細胞因子的過量分泌以緩解免疫應激，受到了國內外研究者的廣泛關注。長鏈n－3多不飽和脂肪酸（LC n－3PUFA）是動物體內必需的多不飽和脂肪酸，包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），可通過影響免疫細胞和炎性細胞的功能實現對炎癥反應的調節，是近年來免疫營養素中的研究熱點。迄今，LC n－3PUFA在外周血單核細胞［1］、巨 噬細胞［2］、小神經膠質細胞［3－4］和呼吸 道 上 皮 細胞［5－6］等 不同 細 胞 中 被 證實具有抗炎作用，其抗炎作用主要是通過減少腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白介素－1β（IL－1β）和白介素－6（IL－6）等促炎細胞因子的產生來實現的。但LC n－3PUFA是否也能減少促炎細胞因子的產生以發揮其在腸上皮細胞中的抗炎作用，目前國內外尚未見報道。由于腸上皮細胞是抵御病原菌通過腸道進入機體的第一道防線［7］，證實 LC n－3 PUFA在腸上皮細胞中的抗炎作用具有重要意義。基于此，本試驗以大鼠腸上皮細胞系IEC－6細胞為研究對象，探討LC n－3PUFA對腸上皮細胞促炎細胞因子基因mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養液購自美國ATCC公司，胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司，DHA、EPA、脂 多 糖 （LPS，大 腸 桿 菌 血 清 型O55∶B5）、牛胰島素（bovine insulin）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑（RNAiso Plus reagent）、反 轉 錄 試 劑 盒（PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser）購自日本TaKaRa公司，實時定量PCR試劑盒（SsoFast EvaGreen Supermix）購 自 美 國 Bio－Rad公司。

1.2 IEC－6細胞培養

正常大鼠腸上皮細胞系IEC－6細胞（第14代）購自美國ATCC公司。取液氮保存的IEC－6細胞，于37℃水浴快速解凍，加入完全生長培養液（90%DMEM、10%FBS、0.1U／mL牛胰島素、100U／mL 青 霉 素 ＋100 μg／L 鏈 霉 素 ），1 000r／min離心5min，去上清液。沉淀的細胞用完全生長培養液懸浮，接種于T25細胞培養瓶（美國Corning公司），于37℃、5%CO2、飽和濕度中培養，每3d換液1次。

1.3 EPA、DHA和LPS處理

當IEC－6細胞達80%左右匯合時，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞計數，以起始細胞密度3×105個／孔接種于細胞培養6孔板（美國Corning公司）中。

試驗分為4個處理，分別為對照、LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS，每個處理3個重復，每孔為1個重復。接種8h后，分別于相應處理中加入DHA、EPA或DMSO（DHA和EPA的溶劑），使它們的終濃度為100μmol／L，預處理細胞48h，再加入LPS使其終濃度為1μg／mL，處理3h后，收集細胞提取總RNA。

1.4 總RNA提取及反轉錄

采用RNAiso Plus reagent提取細胞總RNA，采用Beckman Coulter DU 800核酸蛋白測定儀于260和280nm處檢測RNA的濃度和純度。cDNA合成按照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作說明進行，總RNA為1μg，反應體系為20μL。反應結束后－20℃保存備用。

1.5 實時定量PCR

以甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為管家基因進行實時定量PCR檢測，引物序列見表1。所有實時定量PCR均使用PCR儀（CFX－96 real－time PCR system，美國 Bio－Rad公司）進行擴增和數據分析。20μL反應總體系：cDNA 2μL，上、下游引物各1μL（工作濃度為0.5μmol／L），焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的水6μL，2×SsoFast EvaGreen Supermix 10μL。反應條件為：98℃2min；98℃2s，60℃5s，共45個循環。熔解曲線分析反應程序為自65℃開始，每秒升高0.5℃直至到95℃結束。mRNA相對表達量采用Pfaffl［8］的分析方法進行。

表1 實時定量PCR引物Table 1 Primers for the real－time quantitative PCR

1.6 數據分析

結果以平均值±標準誤表示，采用SPSS 11.5軟件進行統計分析，差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，并用Duncan氏法進行多重比較。顯著水平以P＜0.05為判斷標準。

2 結 果

2.1 LC n－3PUFA對IEC－6細胞中TNF－α的基因mRNA表達的影響

從圖1可知，與對照處理相比，LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS處理均極顯著上調了IEC－6細胞中TNF－α的基因 mRNA表達水平（P＜0.01）。與LPS處理相比，EPA＋LPS處理極顯著下調了IEC－6胞中TNF－α的基因 mRNA表達水平（P＜0.01），而DHA＋LPS處理對IEC－6細胞中TNF－α的基因mRNA表達水平則沒有顯著影響（P＝0.156）。

圖1 LC n－3PUFA對IEC－6細胞中TNF－α的基因mRNA表達的影響Fig.1 Effects of LC n－3PUFA on gene mRNA expression of TNF－αin IEC－6cells

2.2 LC n－3PUFA對IEC－6細胞中IL－1β的基因mRNA表達的影響

從圖2可知，與對照處理相比，LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS處理均極顯著上調了IEC－6細胞中IL－1β的基因 mRNA表達水平（P＜0.01）。與LPS處理相比，DHA＋LPS處理和EPA＋LPS處理分別顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）下調了IEC－6細胞中TNF－α的基因 mRNA表達水平。

圖2 LC n－3PUFA對IEC－6細胞中IL－1β的基因mRNA表達的影響Fig.2 Effects of LC n－3PUFA on gene mRNA expression of IL－1βin IEC－6cells

2.3 LC n－3PUFA 對IEC－6 細 胞 中IL－6的 基 因mRNA表達的影響

從圖3可知，與對照處理相比，LPS、DHA＋LPS和EPA＋LPS處理均極顯著上調了IEC－6細胞中IL－6的基因mRNA表達水平（P＜0.01）。與LPS處理相比，EPA＋LPS處理顯著下調了IEC－6細胞中IL－6的基因mRNA表達水平（P＜0.05），而DHA＋LPS處理對IEC－6細胞中IL－6的基因mRNA表達水平則沒有顯著影響（P＝0.736）。

圖3 LC n－3PUFA對IEC－6細胞中IL－6的基因mRNA表達的影響Fig.3 Effects of LC n－3PUFA on gene mRNA expression of IL－6in IEC－6cells

3 討 論

腸上皮細胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分。IEC－6細胞來自正常大鼠空腸隱窩上皮，體外易于培養，具有原始腸上皮細胞相同的細胞學特性和形態學特征［9］。因此，IEC－6細胞通常成為體外研究營養物質與腸道細胞免疫關系的首選模型。

腸道致病菌均為革蘭氏陰性（G－）菌，LPS是G－菌細胞壁上主要的致病成分。動物的腸腔表面不斷地暴露于G－菌和LPS環境中，腸上皮細胞在受到 LPS刺激時，可產生 TNF－α、IL－1β和IL－6等促炎細胞因子［10－12］。本試驗結果也顯示，LPS刺激后，TNF－α、IL－1β和IL－6的基因 mRNA 表達水平均極顯著升高，暗示細胞處于炎癥反應狀態。本試驗結果還顯示，EPA均顯著削弱了細胞內LPS誘導的TNF－α、IL－1β和IL－6的基因 mRNA 水平的上調，而DHA僅顯著削弱了細胞內LPS誘導的IL－1β的基因mRNA水平的上調，表明EPA在腸上皮細胞中的抗炎作用要優于DHA。然而，在巨噬細胞［2］和呼吸道上皮細胞［5］中的結果則相反。由此可以看出，盡管EPA和DHA均具有的抗炎作用，但其抗炎效果因細胞種類的不同而有所差異，這些差異更深層次地反映了其在不同組織器官甚至特定疾病中的作用效果存在差異。

體內研究LC n－3PUFA的免疫調節作用，以往常采用添加主要成分為EPA和DHA的魚油來進行［13－16］，罕見采用單獨添加 EPA 或 DHA 的報道［17］。盡管魚油被報道對炎性腸病等疾病的治療有一定的有利作用［18］，但由于為EPA和DHA的混合物，限制了人們對單一成分治療效果的認識。本試驗結果也提示，其單一成分的治療效果很可能不同。因此，今后有必要體內研究EPA和DHA分別在炎性腸病等疾病中的治療效果。

4 結 論

本試驗首次證實了LC n－3PUFA在腸上皮細胞中的抗炎作用，且在本試驗條件下EPA的抗炎效果要優于DHA。

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