反芻家畜瘤胃微生物群體感應

冉 濤 譚支良

（1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室，長沙410125；2.中國科學院研究生院，北京100049）

群體感應（quorum－sensing，QS）是微生物通過分泌信號分子來感知細胞（群體）密度的行為，當信號分子達到一定濃度閾值時，通過啟動或抑制特定基因的表達，達到協調微生物群體行為的目的。通常，微生物在生長過程中會不斷地分泌信號分子并釋放到微生物細胞外，同時在其生存環境中累積。而信號分子的分泌與微生物細胞密度密切相關：當細胞密度較低時，微生物只能分泌一定水平的信號分子；隨著微生物細胞密度的增加，胞外信號分子的濃度也不斷增加。當胞外信號分子的濃度達到一定閾值時，信號分子就能被微生物細胞膜上的受體識別，或經特異性的轉運載體轉運至微生物細胞內，與細胞質中相應的受體結合，形成信號分子－受體復合物。該復合物能與DNA鏈特定區域結合或使阻遏物從DNA鏈上脫落，從而激活信號分子的自誘導合成和靶基因表達（表1）。微生物群體的行為可隨著靶基因的大量表達實現同步化，從而使整個微生物群體能更好地適應生存環境的劇烈變化，并在與其他種群微生物的競爭或協同過程中發揮功能［1－7］。目前，研究發現 QS在微生物毒素分泌［8－12］、Ti質粒轉移［13］、生物膜的 形 成［14］、生 物 發 光［15－16］、抗 生 素合成［17］、次級代謝產物的生成［18］和抗微生物肽合成［19］等生理生化過程中發揮了重要作用，甚至連微生物的細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）也受到QS調控［20］。近年來，研究人員發現QS不僅在細菌、真菌的生理生化過程中發揮作用，而且在微生物與其宿主之間的相互作用中也發揮著重要功能［21］。

至今，已經有多種QS信號分子被發現，其中分布最為廣泛、研究最為深入的有N－酰基高絲氨酸內酯（N－acyl homoserine lactones，AHLs）、自誘導肽（autoinducing peptides，AIPs）和自體誘導物－2（autoinducer－2，AI－2）3大類，它們的結構見圖1。AHLs和AIPs分別介導革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的QS［23－25］；而由于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩者均可分泌AI－2，因此AI－2被認為是介導微生物種間交流的通用信號語言［26－28］。其他信號分子，如腎上腺素－去甲腎上腺素類似物（AI－3）［5］、二 酮 哌 嗪 類 （diketopiperazines，DKPs）［29］、假單 孢 菌 屬 喹 諾 酮 信 號 （Pseudomonas quinolone signal，PQS）［30－31］、鏈霉菌屬 γ－丁內酯（γ－butyrolactones）及吲哚（indole）［32－33］等，與前述3種信號分子相比在微生物QS發生過程中并不普遍。

表1 微生物群體感應的發生過程及其關鍵因子Table 1 General steps and key components of quorum－sensing system［22］

圖1 3類主要QS信號分子的結構示意圖Fig.1 Schematic of the structure of three main kinds of quorum－sensing signals［34］

微生物通常采用不同的方式對不同信號分子進行識別，如細胞質轉錄激活因子用于識別AHLs類信號分子，而膜結合雙組分信號轉導系統則識別AIPs和AI－2類信號分子。例如，對由AHLs介導的費氏弧菌（Vibrio fischeri）生物發光現象研究相對較早且較透徹，因此AI－2的LuxI／LuxR系統也常被用作研究革蘭氏陰性菌QS的模式系統［35］。LuxI與LuxR分別由luxI和luxR基因編碼。LuxI是AHLs合成酶，而LuxR既是AHLs的特異性受體，同時也是一種DNA結合轉錄激活元件，二者共同組成LuxI／LuxR信號系統（圖2－A）。AIPs常由相應的前體物經過翻譯后修飾或在轉運至胞外的過程中經剪切加工而成為成熟的信號分子。成熟的AIPs信號分子常含有5～17個氨基酸殘基，AIPs分子不能自由通過細胞膜，需要借助ATP結合盒（ATP－binding cassette，ABC）轉運載體或其他載體、膜通道蛋白的幫助才能到達胞外，如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和糞腸球菌（E.faecalis）分別用附屬基因調節子B（accessory gene regulator B，AgrB）和FsrB來轉運AIPs信號分子［36－37］。黃色葡萄球菌常作為革蘭氏陽性菌QS研究的模式菌株［32］，由其產生的AIPs被膜上的雙 組 份 信 號 轉 導 系 統 （two－component－signaltransduction system）識別而發揮作用（圖2－B）。AI－2是由4，5－二羥基－2，3－戊二酮（dihydroxypentanedione，DPD）衍生產生的可相互轉化的呋喃酮類物質，通常由底物S－腺苷甲硫氨酸（SAM）經過3步酶促反應（甲基轉移酶、Pfs和LuxS）合成［26，38］。

圖2 群體感應發生過程示意圖Fig.2 Schematic of the quorum－sensing system［39］

QS在致病微生物領域的研究相對深入，致病微生物QS的發生對宿主而言是有害的。但是，反芻家畜瘤胃內棲息了大量的微生物，對宿主本身的能量和蛋白質營養與代謝具有重要生理意義。因此，動物營養學家關于瘤胃微生物QS研究的出發點主要集中在以下幾個方面：第一，瘤胃內微生物是否存在QS？第二，瘤胃微生物對營養物質的消化與代謝是否通過QS來調節種間協同作用？第三，瘤胃微生物種間的競爭是否受QS調控？而在其他與瘤胃纖維降解菌有相似活性的微生物中，一些胞外酶的表達是受QS調控的，如胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）中纖維素酶、果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶的表達，青紫色素桿菌（Chromobacterium violaceum）中幾丁質酶的表達等［9，40］。因此，在對瘤胃微生物 QS進行探索時，瘤胃內纖維降解菌［黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白 色 瘤 胃 球 菌 （Ruminococcus albus）、產琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌（B.fibrisolvens）等］成為重點研究對象，旨在解析上述3個方面的問題。盡管研究人員很早之前就從纖維降解菌中克隆到纖維素酶基因［41－42］，但是到目前為止對這些酶的表達調控機制仍不清楚。鑒于此，瘤胃內微生物分泌的AHLs、AIPs和AI－2等3類主要QS信號分子及各自的信號通路等方面的研究就顯得尤其重要。

1 瘤胃微生物AHLs介導的QS

Erickson等［43］首次對瘤胃微生物分泌的AHLs類信號分子介導的QS進行了探索，在其研究中采用青紫色素桿菌CV026和根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）A136 （pCF372）（pCF272）作為報告菌，對飼喂不同精粗比飼糧的牛和鹿的飼前1h和飼后2h的瘤胃液分別進行檢測，在80%的試驗動物瘤胃液中檢測到了AHLs信號分子，且發現飼前與飼后檢測結果無差別。經過高效液相色譜分析，發現AHLs信號分子具有與N－己酰－L－高絲氨酸內酯（N－hexanoyl－L－homoserine lactone，HHL）、N－3氧己酰－L－ 高 絲 氨 酸 內 酯 （N－3－oxo－hexanoyl－L－homoserine lactone，OHHL）和N－辛酰－L－高絲氨酸內 酯 （N－octanoyl－L－homoserine lactone，OHL）相似的色譜性質。與此同時，將瘤胃微生物單菌［纖維桿 菌 （Fibrobacter succinogenes）S85、Prevotella albensis 223／M2／7、白色瘤胃球菌B199、黃色瘤胃球菌和牛瘤胃鏈球菌（Streptococcus bovis）YM150等］在實驗室條件下進行培養，在上清液中并沒有檢測到AHLs信號分子。此外，由于Erickson等［43］并沒有在所有試驗動物的瘤胃液中檢測到AHLs信號分子，因此認為分泌AHLs信號分子的微生物不一定是瘤胃內的必需微生物；且認為由于缺乏瘤胃內某些特有因子的刺激，單一菌群在實驗室條件下不能分泌AHLs，而試驗動物瘤胃中檢測到的AHLs可能是由某些在實驗室條件下不能培養的微生物所分泌的。Edrington等［44］研究了季節對反芻家畜胃腸道不同部位微生物分泌AHLs類信號分子的影響。在春夏秋冬分別從屠宰場采集了牛瘤胃液和直腸內容物樣品，利用根癌土壤桿菌作為報告菌，采用β－半乳糖苷酶活性法對樣品進行了AHLs信號分子檢測。發現在春夏秋3個季節所采集的瘤胃液樣品中均能檢測到AHLs信號分子，而在冬季采集的瘤胃液及直腸內容物樣品中均未檢測到AHLs信號分子。據此認為可從2方面來解釋這一現象：其一，可能是后腸道內的pH偏堿性，使AHLs信號分子發生開環失活；其二，可能是腸道內缺乏產生AHLs信號分子的微生物。

Edrington等［44］和 Hughes等［45］對出血性大腸桿菌（EHEC）與其宿主牛的共生關系進行了研究。EHEC是引起出血性腹瀉和溶血性尿毒癥綜合征在全球范圍內爆發的主要因素，然而作為EHEC的天然宿主，牛卻不表現出任何癥狀。同時，EHEC能從牛的胃腸道中脫落并隨糞便一起排出，若牛糞便處理不當則會造成環境污染且對人類健康構成潛在威脅［46］。EHEC與埃希大腸桿菌（E.coli）一樣，本身不能產生AHLs類信號分子，但是擁有能感應這類信號分子的受體SdiA［47］。SdiA是LuxR的同源蛋白質，不同的是LuxR在微生物種內交流中發揮作用，SdiA在微生物種間交流中發揮功能。Edrington等［44］采用14只斷奶羔羊作為試驗動物，對其接種EHEC，飼養8d后屠宰尸檢并采集胃腸道內容物樣品，發現所有樣品均呈 AHLs陰性。Hughes等［45］指出，SdiA識別AHLs后能夠調控EHEC中促進其在宿主體內的定植基因的表達，并認為這種QS可能是共生細菌感應并適應其宿主環境的一種普遍機制。Edrington等［44］和 Hughes等［45］的研究均證實對于反芻家畜消化道微生物而言只有瘤胃內微生物能分泌AHLs信號分子。上述研究為對AHLs－SdiA介導的EHEC在牛消化道內定植進行有效控制，進而為降低肉、奶產品及產品深加工時交叉污染的幾率，并減少EHEC的環境排放帶來了曙光。

Erickson等［43］的研究還發現盡管牛飼糧精粗比與檢測到的瘤胃內AHLs信號分子水平沒有相關性，但是飼喂高精料的試驗動物瘤胃微生物所分泌的AHLs比飼喂高粗料的試驗動物瘤胃微生物所分泌的AHLs具有更長的側鏈。據此結果應該可以理解為牛瘤胃內可能存在多種能產生AHLs信號分子的微生物，在飼喂不同精粗比飼糧時，瘤胃內具有不同的優勢微生物種群：飼喂高精粗比飼糧時，分泌長鏈AHLs的微生物為優勢種群；而飼喂低精粗比飼糧時，分泌短鏈AHLs的微生物為優勢種群。但是，在瘤胃微生物降解利用不同營養物質時分泌不同AHLs信號分子的微生物是直接參與營養物質降解還是感應其他微生物種群發揮降解功能，需要在未來的研究中不僅對分泌不同AHLs信號分子的瘤胃微生物種群進行甄別，而且要對其功能及機制進行進一步探索。

2 瘤胃微生物AI－2介導的QS

Mitsumori等［48］對瘤胃微生物能否產生 AI－2類信號分子進行了研究。利用哈氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170作為報告菌，發現在瘤胃液和溶纖維丁酸弧菌、反芻真桿菌（E.ruminantium）、黃色瘤胃球菌、溶淀粉琥珀酸單孢菌（S.amylolytica）等純培養物上清液中均檢測到了AI－2類似物。Lukas等［49］在對腸道共生細菌中AI－2信號分子進行檢測時，也發現白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌能夠分泌AI－2類似物。

已知LuxS是由luxS基因編碼的AI－2信號分子合成酶，因此，luxS基因常作為判斷某種微生物是否具有AI－2介導的QS的指標之一。研究中常根據已知的luxS基因序列設計引物，以待檢測微生物的DNA為模板，進行luxS基因的克隆檢測。Mitsumori等［48］采用巢式PCR，在混合瘤胃微生物和棲瘤胃普雷沃氏菌棲瘤胃亞種（Prevotella ruminicola subsp.Ruminicola）和黃色瘤胃球菌中克隆到了luxS基因同源序列（Genbank登錄號：AB094404－AB094409）。然而，Lukas等［49］同樣采用巢式PCR方法卻未能在黃色瘤胃球菌中克隆到luxS基因同源序列，可能的原因是在第2階段PCR采用了與 Mitsumori等［48］不同的引物所致。Miller等［50］完成了對黃色瘤胃球菌FD－1全基因組測序的草圖工作（Genbank登錄號：ACOK00000000.1），指出黃色瘤胃球菌存在luxS基因的同源序列，但與Mitsumori等［48］克隆的黃色瘤胃球菌的luxS基因同源序列進行比對后發現二者同源性較低，這一差異可能是由于試驗菌株不同而導致的。由于目前對黃色瘤胃球菌的QS研究較少，將來的研究應該集中到解析瘤胃中AI－2類似物的結構，克隆瘤胃內不同微生物種群催化AI－2分泌的相關合成酶（LuxS）的基因，以及探索AI－2作為種群間或種群內QS的信號分子的轉導通路與調控機制。

3 瘤胃微生物AIPs介導的QS

至今為止的研究發現金黃色葡萄球菌的QS還可通過AIPs信號分子來介導，參與QS過程的關鍵因子包括附屬基因調節子D（AgrD）、AgrB、附屬基因調節子C（AgrC）和附屬基因調節子A（AgrA），別由agrD、agrB、agrC和agrA 基因編碼，其中AgrD和AgrB參與合成具有活性的AIPs信號分子，AgrC和AgrA則構成膜結合雙組分信號轉導系統。盡管不同微生物產生的AIPs信號分子不同，但它們均采用膜結合雙組分信號轉導系統對AIPs信號分子進行識別，因此，agrC基因是研究AIPs介導的QS的重要切入點。Burrell等［51］對產甲烷生物反應器中的纖維降解菌進行了研究，發現這些纖維降解菌主要屬于硬壁菌門梭菌屬，且通過熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）研究發現這些纖維降解菌具有一些奇特的行為，如在纖維素底物上定植緩慢、形成生物膜、隨機附著在底物上并呈分散狀生長，幾乎在纖維素顆粒上完全占主導地位。為了弄清這些細菌降解纖維素的機制，Burrell等［51］以這些細菌總DNA為模板，采用根據已知的agrC基因序列設計的簡并引物進行PCR，結果克隆到的基因片段與熱纖梭菌（C.thermocellum）agrC基因高度同源，因此，認為這些纖維降解菌可能具備AIPs介導的 QS［52］。Sun等［53］采用2對根據金黃色葡萄球菌中的agrC基因設計的特異性引物，旨在在牛瘤胃微生物中克隆到該基因的同源基因。盡管從克隆到的基因序列推出的氨基酸序列與AgrC相似性不高，但發現與檸檬酸鹽代謝過程中涉及的組氨酸蛋白激酶具有高度的相似性。其研究結果揭示了某些瘤胃微生物的檸檬酸鹽代謝受到膜結合雙組份信號轉導系統的調控。

變異鏈球菌（Streptococcus mutans）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的遺傳轉化、生物膜的形 成 等 均 受 ComC 介 導 的 QS 調 控［54－55］。ComC是一種感受態的激活肽（competence－stimulating peptide），常以沒有活性的前體肽的形式被合成，在轉運過程中被切除前導肽而成為成熟的信號分子。當ComC在胞外累積到一定的濃度時，就能被雙組分信號轉導系統ComDE識別，ComD和ComE分別為組氨酸激酶受體和應答調節子。Yoshii等［56］在牛瘤胃鏈球菌中克隆到了comCDE基因簇，證明了牛瘤胃鏈球菌存在類似的雙組分信號轉導系統。Asanuma等［57］研究發現牛瘤胃鏈球菌的生長和遺傳轉化受到自誘導肽ComC與雙組分信號轉導系統ComDE的調控，首次報道了瘤胃微生物存在AIPs介導的QS。Asanuma等［57］采用構建comC基因缺失突變，比較研究了缺失突變與添加外源ComC對其蛋白質表達和生長情況等方面的影響，證明了comCDE基因簇通過QS調控牛瘤胃鏈球菌的生長和遺傳轉化。這一發現對于反芻家畜生產系統應用相應的調控技術以防止牛瘤胃鏈球菌過度生長，避免瘤胃酸中毒、減少甲烷產量、提高反芻家畜飼料利用率具有重要意義。

研究證明很多細菌素類同時具有抗微生物活性和介導QS的雙重功能，如乳酸桿菌屬產生的乳鏈球菌素（nisin）［58］。瘤胃微生物中也有相當多的微生物能夠產生細菌素，如溶纖維丁酸弧菌［59－60］、糞腸球菌［61］、活潑瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）［62］等。Odenyo等［63］和 Chan等［64］發 現 白 色瘤胃球菌產生的一種熱穩定的類似細菌素的化合物，能對黃色瘤胃球菌和丁酸弧菌的生長造成抑制。白色瘤胃球菌細菌素是否與乳酸桿菌屬產生的乳鏈球菌素一樣具有介導QS的功能？而白色瘤胃球菌又是如何感知黃色瘤胃球菌和丁酸弧菌的存在及數量的？此外，目前發現的很多具有QS的革蘭氏陽性菌都屬于硬壁菌門（Firmicutes），而瘤胃中的主要纖維降解菌白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌也是屬于硬壁菌門，那它們是否具有agr、fsr和com等基因的同源基因呢？上述科學問題均需要在今后的研究中得到解答。

4 小結與展望

至今已證實部分瘤胃微生物確實存在AHLs、AIPs、AI－2等介導的QS，但與瘤胃內數量巨大的微生物種群相比相關研究仍顯微不足道。若與致病微生物QS研究已經到應用水平相比，瘤胃微生物QS研究目前僅限于信號分子檢測并求證其存在與否的層次。在未來瘤胃微生物QS領域的研究中，研究分泌信號分子的瘤胃微生物種類及QS機制是基礎；其次，需要闡明瘤胃微生物對各類營養物代謝的過程是否受QS調控，同時需要回答瘤胃微生物彼此競爭與共生、瘤胃微生物與反芻家畜宿主間的互作是否受QS調控；隨后，以通過建立瘤胃微生物QS的調控技術來提高反芻家畜的飼料利用效率。

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