MAP30基因轉化煙草的研究

欒 杰，陳秀玲，侯莉華，李小梅，王傲雪*

（1.東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030；2.大慶市教師進修學院，黑龍江 大慶 163311）

MAP30是從苦瓜果實和種子中分離純化得到的一種單鏈、I型核糖體失活蛋白，其分子質量為30 ku[1]。MAP30不但具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種生物學活性，而且它還具有特異性，只對病毒感染的細胞有效，對正常細胞無毒副作用[2]。MAP30這些獨特的優勢，使其具有成為抗腫瘤、抗病毒的治療藥物的可能性[3-6]。煙草是基因工程生產的模式植物，其葉片中富含蛋白質，一般為15%，可高達20%，蛋白質提取后呈結狀，無異味，水溶性好。研究表明，煙草懸浮細胞通常是人們首選培養細胞，由于植物細胞培養的生產環境可以人為控制、下游純化較為方便，因此比較適于生產藥用蛋白，具有開發利用的廣闊前景。

本研究以煙草葉片為受體，通過農桿菌介導法將MAP30基因導入煙草基因組中，以煙草為生物反應器為生產MAP30藥用蛋白提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草BY2種子、植物表達載體pBIMAP30質粒及農桿菌EHA105菌株由本實驗室保存。限制性內切酶（Bam HⅠ、SacⅠ）、pfu酶購自TaKaRa公司；卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）購自Bio BASIC公司；標準分子質量Trans2K購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基

YEP培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，蒸餾水定容到1000 mL，NaOH調節pH至7.0，固體培養基含0.8%瓊脂。M1：MS基本培養基；2%MSO菌液重懸培養基：MS粉4.3 g、肌醇100 mg、VB1（1 mg·mL-1）0.4 mL、蔗糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL；M2：預培養及共培養培養基，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA；M3：分化及篩選培養基，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA+500 mg·L-1Cef；M4：生根培養基，1/2 MS+500 mg·L-1Cef，pH 5.8[7]，固體培養基均含0.8%瓊脂，培養基均121℃、高溫、高壓滅菌20 min。

1.2.2 煙草無菌苗的制備

將煙草種子用70%酒精沖洗30 s，無菌水沖洗3～4次后，在含有10%的NaClO溶液中滅菌10 min，再用無菌水沖洗3～4次，將種子擺在M1培養基中，光照培養箱中培養，當苗長出4～5片真葉時進行轉化[8]。

1.2.3 植物表達載體轉化農桿菌

通過凍融法將植物表達載體質粒轉入農桿菌EHA105中，在含有50 mg·L-1Kan、50 mg·L-1Rif的培養基上培養48～96 h至有單菌落長出，提取農桿菌質粒，以兩條特異引物1ST-S：5'AAGGATCC ACCATGGTGGTATGCTTACTAC 3'；1ST-A：5'AT TCACAACAGATTCCCC 3'進行PCR鑒定，反應條件為94℃預變性5 min；94℃變性30 s、54℃退火20 s、72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸5 min。質粒用Bam HⅠ、SacⅠ進行雙酶切鑒定。

1.2.4 侵染菌液的制備

挑取轉化的農桿菌單菌落接種于含有50 mg·L-1Kan和50 mg·L-1Rif的10 mL YEP液體培養基中，28 ℃，200 r·min-1過夜震蕩培養至OD600為0.5左右；按1∶10的比例將菌液轉接入50 mL YEP培養基中進行二次活化，200 r·min-1，28℃繼續震蕩培養至OD600約0.5；菌液在4 ℃、10000 r·min-1條件下離心10 min，菌體用50 mL 2%的MSO培養基重新懸浮；使菌液OD600=0.5準備用于侵染。

1.2.5 選擇培養中Kan選擇壓的確定

本試驗共設置0、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg·L-1Kan 11個水平，分別于15、30 d后統計愈傷組織誘導率及芽誘導率。

1.2.6 煙草遺傳轉化

1.2.6.1 預培養時間對煙草葉片轉化的影響

煙草葉片切成0.5 cm2接種在M2培養基上，設6個時間梯度：0、12、24、36、48、72 h，每個處理60個外植體。

1.2.6.2 共培養時間對煙草葉片轉化的影響

各處理外植體用2%MSO培養基重懸菌液侵染20 min后接種于M2培養基，共培養時間設為：0、12、24、48、72、96 h，然后轉入M3培養基培養，30 d后觀察子葉不定芽分化情況。

1.2.6.3 轉化煙草外植體再生成植株將長至2～4 cm不定芽切下，轉入M4上誘導生根。苗長至4 cm左右時，揭開封口膜，在室內煉苗2 d，栽于溫室培養。

1.2.7 抗性植株的檢測

1.2.7.1 轉化植株的PCR檢測

取7株轉化抗性植株與1株未轉化植株，采用CTAB法提取植物基因組DNA，檢測MAP30基因是否已經整合到煙草基因組中。

1.2.7.2 轉化植株的RT-PCR分析

采用Trizol法提取PCR擴增呈陽性轉化植株葉片的總RNA，逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體轉化農桿菌的PCR及酶切鑒定

從圖1可以看出，經PCR擴增出867 bp大小的條帶，鑒定其為陽性質粒。將能正確擴增的質粒進行Bam HⅠ，SacⅠ雙酶切，結果與預期片斷大小相同，如圖2所示。

圖1 EHA105單菌落的PCR產物Fig.1 PCR products of EHA105 single clone

圖2 pBIMAP30的雙酶切電泳圖譜Fig.2 Digestion products of pBIMAP30 by enzyme Bam H I and Sac I

2.2 選擇培養中Kan選擇壓的確定

研究表明，隨著Kan濃度增加，愈傷組織誘導率和芽誘導率隨之降低，當Kan濃度為90 mg·L-1時，愈傷組織誘導率和芽誘導率都較低，當其濃度達到100 mg·L-1時，葉片分化完全受抑制。所以本試驗選擇Kan濃度為100 mg·L-1，如圖3所示。

圖3 不同Kan濃度對煙草愈傷組織誘導率和芽誘導率的影響Fig.3 Effect on of different Kan concentrations on the rate of tobacco callus and bud

2.3 預培養時間對煙草葉片轉化和再生的影響

由表1可知，預培養時間較長或較短均不利于轉化及再生。36 h預培養時，抗性愈傷組織和抗性芽形成最多，愈傷組織誘導率為76.4%，芽誘導率74.5%。因此，以36 h預培養為宜。

表1 預培養時間對轉化效率的影響Table 1 Effect of pre-culture time on transformation

2.4 共培養時間對煙草葉片再生及轉化的影響

結果見表2。

表2 共培養時間對轉化效率的影響Table 2 Effect of different co-culture time on transformation

從表2可以看出，48 h共培養對外植體愈傷組織誘導率和芽誘導率都較高。

2.5 抗性轉化植株的獲得

通過農桿菌侵染、Kan抗性篩選、誘導生根、移栽，獲得抗性煙草植株，如圖4所示。

圖4 煙草遺傳轉化過程Fig.4 Process of tobacco genetic transformation

2.6 轉化植株的PCR檢測

對轉化植株進行PCR檢測，5株轉化煙草植株867 bp處均有電泳條帶，而對照無條帶。

如圖5所示，說明外源基因已經整合到煙草基因組中。

圖5 轉化植株的PCR檢測Fig.5 PCR detection of transgenic tobacco plant

2.7 轉化植株的RT-PCR檢測

對5株PCR檢測呈陽性的植株，提取葉片總RNA進行RT-PCR分析（見圖6）。

圖6 轉化植株的RT-PCR檢測Fig.6 RT-PCR detection of transgenic tobacco plant

如圖6所示，有2株煙草轉化植株RT-PCR呈陽性，說明MAP30基因在轉錄水平表達。

3 討論與結論

在農桿菌介導的遺傳轉化中，適合T-DNA轉移的反應條件和感受細胞的形成是成功轉化的關鍵[9]。選擇適宜的預培養時間能使傷口部分愈合，使其對農桿菌侵染耐受性增強。預培養時間過長，傷口愈合部分增多，農桿菌侵染的困難增加，外源基因不易導入。T-DNA轉移到植物細胞是在共培養這個階段完成的，共培養時間的長短將直接影響到目的基因整合及轉化細胞的數量。外植體經過農桿菌侵染后，T-DNA須經16 h以上才能向植物細胞轉移[10]。在本研究中，煙草葉片預培養36 h轉化效率最高，煙草轉化時農桿菌與外植體共培養時間以48 h為宜。MAP30是一種非常有效的廣譜抗腫瘤、抗病毒植物蛋白。基于成本及來源等方面因素，植物基因工程是大批量生產MAP30重組蛋白的首選方法。煙草作為基因轉化的模式植物被廣泛用于遺傳轉化研究[11-12]。煙草生長周期短，易于得到再生植株，蛋白質含量高，作為生物反應器生產外源蛋白，生產成本低，適合大規模生產。

盡管有許多問題還需要作進一步探討，但利用轉基因植物生產醫藥蛋白是一種經濟有效的途徑。

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