芽胞桿菌產生的脂肽類化合物在防治油菜菌核病中的作用

伍輝軍，王 帥，湛 江，馬玲莉，高學文

（南京農業大學植物保護學院，農作物生物災害綜合治理教育部重點實驗室，南京 210095）

油菜菌核病是我國油菜第一大病害，該病由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）引起，一般發病率為10%～30%，嚴重時可達80%以上[1]。油菜菌核病一旦發作，常會連年發生，嚴重影響油菜產量和質量，造成巨大經濟損失，病情嚴重時，可使油菜減產30%[2]。

目前，尚未發現真正抗核盤菌的油菜種質資源，防治油菜菌核病主要依賴化學防治。然而，化學農藥已使核盤菌產生強抗藥性[3]，導致化學農藥使用量和使用頻度不斷加大，增加了環境和農產品中農藥殘留量，對環境和人類健康構成嚴重威脅。因此，亟需研究和開發新型環保菌核病生物防治藥劑。

近年來，生物防治以其無公害、無污染等優點受到廣泛關注。目前，在生防領域中，芽胞桿菌（Bacillus spp.）是研究和應用相對較多的一類細菌，該菌分布廣泛，能產生抗逆性強的芽胞、多種抗生素和酶類物質[4]。芽胞桿菌防治植物病害的主要活性物質是脂肽類化合物，包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和泛革素（Fengycin）三大類[5]。其中，Surfactin具有抑制病毒和細菌的活性[5]。泛革素對絲狀真菌具有很強的抑制效果[6]。伊枯草菌素能有效抑制真菌和細菌[7]。表面活性素和泛革素還能作為激發子誘導植物產生抗病性[8]。因此，可以利用芽胞桿菌產生的這類獨特化合物，研制新型環保生物源農藥。

本研究檢測了芽胞桿菌產生的脂肽類化合物抑制油菜菌核病菌的活性，并采用油菜離體葉片接種法和田間試驗，評價脂肽類化合物防治油菜菌核病效果。該研究有助于油菜菌核病的生物防治，以及新型環保生物源農藥研制。

1 材料與方法

1.1 材料

油菜品種為Z生3。油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）G4菌株和解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B3菌株為本實驗室保存。芽胞桿菌培養采用LB和Landy培養基[9]；真菌培養采用PDA培養基[10]。42%克菌凈可濕性粉劑購置于湖南省海洋生物工程有限公司。脂肽類生物農藥乳油的制備：芽胞桿菌在Landy培養基中進行發酵，發酵條件參考王帥等方法[11]。發酵結束后，采用酸沉淀法提取脂肽類化合物，并對粗提的脂肽類化合物進行稱重，再溶于助溶劑乙醇，最終配制成50 mg·L-1脂肽類生物農藥乳油。

1.2 脂肽類生物農藥乳油抗菌活性檢測

以油菜菌核病菌為指示菌，用紙碟法檢測脂肽類生物農藥乳油抗菌活性。先用打孔器從培養的菌核病菌上取直徑為4 mm的菌絲塊，移至PDA平板中央，在距離中央兩側各1.5 cm處放置直徑為4 mm濾紙片，在濾紙上加脂肽類生物農藥乳油10 μL，對照以無菌水測試，每個試驗3個處理，于28℃下培養3 d后測量各處理抑菌圈。

1.3 油菜離體葉片接種試驗

在油菜10葉期，摘取葉位一致、大小相近的無破損、無病蟲害葉片，自來水清洗，晾干，滴加0.5 mL脂肽類生物農藥，涂抹均勻，用滅菌去離子水處理葉片作對照（CK），自然晾干，接種生長旺盛的油菜菌核病菌菌絲塊，每片葉片放置2個菌絲塊，于25℃保濕培養2 d，然后測量病斑直徑。每次處理重復4次。

1.4 脂肽類生物農藥乳油防治油菜菌核病的田間試驗

試驗共設脂肽類生物農藥乳油B3、G4、42%克菌凈可濕性粉劑和空白對照4個處理。小區面積40 m2，隨機區組排列，每個處理重復4次。各藥劑使用濃度分別為：脂肽類生物農藥每畝40 mL，42%克菌凈可濕性粉劑3.34 g·hm-2。分別在油菜的初花期和盛花期施藥，每次施藥按藥量兌水3.34 kg·hm-2，用長江-10A型手動噴霧器均勻噴霧（噴孔直徑1.3 mm，工作壓力3～4 kg·cm-2），空白對照噴等量清水。于盛花期藥后10 d調查1次。每小區棋盤式10點調查，每點調查5株（每個小區50株），調查時不要在邊行取樣，記載各級發病株數，計算發病率、病情指數和防治效果。采用統計學軟件SPSS對上述處理間的試驗結果進行差異顯著性分析，比較試驗中不同處理間差異。

2 結果與分析

2.1 脂肽類生物農藥乳油B3和G4對油菜菌核病菌的平板拮抗作用

結果表明，脂肽類生物農藥乳油B3和G4均能夠明顯抑制油菜菌核病菌菌絲生長（見圖1）。B3和G4平均抑菌圈面積分別為4.71和3.85 cm2，差異顯著性分析表明，抑菌圈在顯著性水平5%時各處理間與清水對照間有顯著性差異，且B3效果要好于G4；在顯著性水平1%時各處理與清水對照存在極顯著性差異，B3和G4處理之間無顯著性差異。

圖1 B3和G4對油菜菌核病菌菌絲生長的影響Fig.1 Inhibition effect of B3 and G4 on S.sclerotinorium in plate

2.2 油菜離體葉片接種核盤菌試驗

試驗結果表明，在接種核盤菌后24 h，對照葉片開始發病，此時B3和G4處理葉片均未發病（見圖2-A）。在接種核盤菌后36 h，對照葉片開始大面積發病，G4處理葉片開始輕微發病，B3處理葉片未發病（見圖2-B）；在接種核盤菌后48 h，對照葉片開始大面積腐爛，G4處理葉片有直徑為1.5 cm左右的病斑，B3處理葉片未發病，而對照處理的葉片則出現直徑為3.7 cm左右的病斑（見圖2-C）。差異顯著性分析表明，各處理間及與清水對照在顯著性水平1%時存在極顯著性差異。此外，接種后48 h內，對照逐漸退色，而處理葉片依然鮮綠。

圖2 油菜離體葉片上B3和G4對油菜菌核病菌的抑制作用Fig.2 B3 and G4 supress the growth of S.sclerotinorium on detached leaves of rape

2.3 脂肽類生物農藥乳油B3和G4防治油菜菌核病的田間試驗

試驗結果表明，在連續兩年的試驗中經B3和G4處理后，油菜病株率與病情指數逐年下降，并且在油菜整個生育期都具有很好防治效果（見圖3，表1）。第一年B3和G4防效分別達到49.7%和44.8%；第二年B3和G4防效分別達到55.8%和46.3%。與化學農藥克菌凈在兩年內的防效51.5%和47.4%相近。差異顯著性分析表明，在第一年試驗中，在差異顯著性5%時B3與克菌凈處理間無顯著性差異；G4與克菌凈處理間有顯著性差異（見表1）。在第二年試驗中，在差異顯著性5%時B3與克菌凈處理間有顯著性差異，且B3處理防效高于克菌凈；G4與克菌凈處理間無顯著性差異（見表1）。

圖3 脂肽類生物農藥乳油防治油菜菌核病Fig.3 Controlling of S.sclerotinorium with biopesticides of lipopeptide

表1 脂肽類生物農藥乳油防治油菜菌核病的田間試驗Table 1 Controlling of S.sclerotinorium with biopesticides of lipopeptide in the field

2.4 脂肽類生物農藥乳油B3和G4對油菜生長的影響和對油菜生長的安全性

油菜經脂肽類生物農藥乳油B3和G4處理后，于盛花期藥后10 d調查，結果表明，脂肽類生物農藥乳油B3和G4處理均具有促進油菜生長的作用（見表2）。每667 m2油菜經脂肽類生物農藥乳油B3或G440 mL處理后，油菜株高分別為145.8和144.7 cm，地上部鮮重分別為293.3和261.2 g。差異顯著性分析表明，株高方面在顯著性水平5%時，脂肽類生物農藥乳油B3與清水對照有顯著性差異；在顯著性水平1%時各處理與清水對照均無顯著性差異；地上部鮮重在顯著性水平5%和1%時脂肽類生物農藥乳油各處理與清水對照均有顯著性差異。

表2 脂肽類生物農藥乳油對油菜生長的影響Table 2 Effects of biopesticides of lipopeptide on the growth of rape in field

3 討論與結論

芽胞桿菌屬于植物根圍促生細菌（Plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR），其通過成功定殖至植物根際、體表或體內，與病原菌競爭生存空間和營養物質，還能分泌抗菌物質以抑制病原菌生長，同時誘導植物產生系統抗性抵御病原菌入侵，從而起到生防作用。目前，在國內外商品化的芽胞桿菌生防制劑中都是直接利用菌體作為活性物質，生防效果不穩定，易受到環境因素影響。芽胞桿菌防治植物病害主要的生防機制是產生拮抗物質。自Johnson等報道芽胞桿菌能產生抗菌物質以來[12]，研究者從芽胞桿菌中發現60多種拮抗物質，而最主要的拮抗物質就是通過非核糖體途徑合成脂肽類化合物，根據其結構上的差異分為Surfactin、Iturins和Fengycin三類。本研究直接利用芽胞桿菌代謝產物脂肽類化合物防治油菜菌核病，檢測脂肽類化合物在實驗室和田間防治效果。

脂肽類生物農藥乳油B3和G4對油菜菌核病的平板拮抗試驗表明，B3和G4與核盤菌形成明顯拮抗圈（見圖1），當B3和G4與核盤菌菌落接觸后，核盤菌菌落停止生長，對照則長滿整個平板。油菜離體葉片接種試驗中，脂肽類生物農藥乳油B3和G4處理油菜葉片后接種核盤菌，B3和G4對核盤菌在葉片上的侵染和擴展有較強抑制作用，尤其是B3處理完全抑制核盤菌侵染（見圖2）。在田間試驗中，經過不同處理后的油菜病株率和病情指數都大大低于對照。其中，B3處理最高防效達55.8%，顯著高于克菌凈防效（見表1），說明脂肽類生物農藥乳油B3和G4在田間條件下能對核盤菌定殖和生長起抑制作用。先前研究表明，B3菌株能夠產生脂肽類化合物Iturins和Fengycin，G4菌株能夠產生脂肽類化合物Surfactin、Iturins和Fengycin，其中Iturins和Fengycin都具有很強的抑制真菌的活性[13]。因此，本試驗認為脂肽類生物農藥對油菜菌核病的防治主要是由于Iturins和Fengycin對油菜菌核病原菌的抑制作用。試驗表明，脂肽類生物農藥乳油對環境和作物安全，未發生藥害現象且具有顯著促生效果（見表2）。

在植物病害生物防治領域中，利用生防菌及其產生的抗菌物質是生物防治的重要研究內容。目前，直接利用芽胞桿菌產生脂肽類化合物防治植物病害還未見報道，因此該研究將有助于新型環保型生物源農藥開發和研制。

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