SSR分子標記分析彩色馬鈴薯品種間的遺傳關系

李先平，王冬冬，陳秀華,，朱延明，陳 勤,*

（1.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.加拿大農業及農業食品部萊斯布里奇研究中心，萊斯布里奇，艾伯塔省，加拿大 T1J4B3；3.云南省農業科學院經濟作物研究所，昆明 650205）

馬鈴薯是世界上種植最廣泛的糧食作物之一，也是人類飲食中重要的抗氧化活性食物的來源。馬鈴薯中含有多酚、類胡羅卜素、類黃酮和維生素C等多種抗氧化活性物質。近年開發的彩色馬鈴薯除含有以上各種抗氧化活性物質外，還含有多種花青素色素，使其抗氧化活性比常見的白肉和黃肉馬鈴薯增加2～3倍[1]，食用彩色馬鈴薯更有益于人體健康，這使得育種學家把目標集中到高色素含量的彩色馬鈴薯新品種選育上。Reyes等研究發現彩色馬鈴薯塊莖薯皮含有較多的花青素色素[2]，其含量比薯肉高出0.9～1.6倍，但薯皮對花青素的貢獻只有整個塊莖的20%左右，馬鈴薯花青素主要還是來自于薯肉，因而培育高色素含量彩色馬鈴薯新品種關鍵在于薯肉色素含量高低。

隨著彩色馬鈴薯抗氧化、抗癌、抑制腫瘤活性等諸多保健功能的發現利用，彩色馬鈴薯成為當前馬鈴薯育種研究熱點。目前彩色馬鈴薯的研究主要集中于色素含量、色素穩定性及保健功能等方面，研究使用的彩色品種為國際上現有品種如“Russian Blue”，“Purple Peruvian”和“Purple Majesty”等紫肉品種和“Mountain Rose”、“Red Cardinal”等紅肉品種[3-4]。而這些彩色馬鈴薯品種來源、遺傳背景等尚不清楚，因此對彩色馬鈴薯品種間遺傳關系進行研究，利用親緣關系較遠的彩色馬鈴薯彼此雜交，發揮雜種優勢，有利于培育色素含量更高的彩色馬鈴薯新品種。

分子標記技術廣泛用于植物遺傳育種、品種鑒定、生物多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位與克隆和分子標記輔助育種等諸多領域。其中SSR（簡單重復序列），又稱微衛星（Microsatellite），由1～6個核苷酸為單位多次串聯的DNA序列組成，其序列側翼具有高度保守的DNA序列，重復次數差異較大，是檢測多態性的有效方法。SSR具有試驗操作簡便、重復性好、多態性高、數量和信息量豐富、共顯性遺傳等特點，被廣泛用于動植物遺傳研究中。1995年Veilleux等首次利用SSR分子標記研究馬鈴薯[5]，其后SSR分子標記被廣泛應用于馬鈴薯的遺傳關系分類[6-8]、品種鑒定[9]、核心種質資源收集評價[10]等領域。

目前已開發200多個馬鈴薯SSR分子標記引物，Milbourne等公布了遍布馬鈴薯12條染色體的112個SSR分子標記引物[11]；Ashkenazi等開發出30對SSR引物用于研究馬鈴薯野生種與普通栽培種的多態性[12]；Feingold等通過EST數據庫的DNA序列信息設計開發了64個SSR引物用于馬鈴薯遺傳圖譜構建[13]。Ghislain等于2004年通過對近1000個馬鈴薯品種和品系的篩選鑒定[9]，從156對SSR引物中篩選出18對表現好的SSR引物用于馬鈴薯研究，并于2009年通過對742個馬鈴薯品種的篩選鑒定，將多態性好、信息量大、重復性好的SSR引物從原來的18對SSR引物擴增至24對[14]。Spooner等用50對SSR引物對742個馬鈴薯品種8個馬鈴薯野生種進行多態性分析，對不同染色體倍性，不同來源的馬鈴薯進行分類研究[10]。

相較于其他分子標記技術，SSR分子標記多態性好，簡便易用，重復性好，更適合于植物品種鑒定和遺傳多樣性研究。本文旨在利用SSR分子標記研究彩色馬鈴薯品種間的遺傳關系，分析彩色馬鈴薯的遺傳背景及其親緣關系，以便更好的為彩色馬鈴薯遺傳育種服務。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗采用來自北美、歐洲和國際馬鈴薯中心不同顏色馬鈴薯品種及彩色馬鈴薯育種中間材料進行研究。表1列出了試驗材料的品種名稱、來源和品種的皮色、肉色等主要特征特性。

表1 用于SSR分析的彩色馬鈴薯品種Table 1 Color potato cultivars for SSR marker analysis

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及SSR分析

DNA提取使用植物DNA提取試劑盒（D Neasy Plant Mini Kit，Qiagen，Maryland，USA），用0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA質量及濃度。根據文獻報道[9-12]，選擇多態性好的SSR引物進行彩色馬鈴薯多態性研究，SSR引物信息如表2所示。

表2 用于彩色馬鈴薯品種遺傳多樣性分析的SSR引物信息Table 2 SSR primer for genetic diversity analysis of color potato cultivars

續表

PCR反應使用PCR反應試劑盒（Taq PCR Master Mix Kit，Qiagen），反應體系15 μL，反應程序為：94℃預變性3 min；然后進行35個PCR循環：94℃變性30 s，退火溫度（引物退火溫度見表2）退火30 s，72℃延伸50 s；最后72℃延伸7 min。擴增反應在PCR擴增儀（Eppendorf mastercycler）上進行。PCR產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，200 V電泳1～1.5 h。電泳后用1%硝酸銀進行銀染，銀染好的凝膠用數碼相機在膠片觀察燈下進行拍照。凝膠電泳和銀染方法參照國際馬鈴薯中心的實驗程序。

1.2.2 數據分析

根據SSR位點上銀染帶型的有無，轉換為二進制數據，有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為“0”。二進制數據組成矩陣，利用簡單匹配系數（Simple matching coefficient，SM）計算相似性系數，然后進行UPGMA聚類分析，自動生成樹狀圖。NTSYS-PC 2.1軟件用于計算遺傳相似性和聚類分析。

多態性信息量值PIC（Polymorphism index contents）采用Nei's多樣性指數公式獲得：PICk=1-∑(Pi)2，其中Pi是帶有第i個等位基因在k位點上的群體比例，計算每個微衛星位點的PIC值。

2 結果與分析

研究使用Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取DNA。結果表明試劑盒提取的DNA質量好，無降解，品種間DNA提取量均勻（見圖1），經稀釋后可用于SSR分析。

圖1 馬鈴薯DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agrose electrophoresis of potato DNA

2.1 SSR引物多態性分析

表3顯示了SSR引物對彩色馬鈴薯進行分析的多態性信息。41對SSR引物在試驗中共獲得152個SSR擴增條帶，其中有24條帶為所有品種共有，在品種間不具有多態性；另外128條帶在品種間存在差異，顯示多態性。SSR引物在各品種間顯示1～11個多態性條帶，PIC值變幅為0.32～0.94，平均值0.76。其中PIC值達到和高于0.9的有4個：引物STG0016在PCR擴增中獲得11個條帶，其中10個顯示為多態性條帶，PIC值為0.94；引物STI003的9個位點均為多態性條帶，PIC值為0.93；引物STI024的9個位點中8個顯示為多態性條帶，PIC值為0.93；引物STM1104的6個均為多態性條帶，PIC值為0.9。以上4對引物在品種間顯示了良好的多態性，適合用于馬鈴薯品種間的多態性分析；PIC在0.80～0.89之間的有15對引物，亦表現出較好的多態性；PIC值在0.70～0.79的有12對引物；PIC值在0.60～0.69之間的有4對引物；PIC值在0.50～0.59之間的有5對引物；PIC值低于0.5的有1對引物。圖2為引物STI024擴增PCR產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。

表3 SSR引物分析30個彩色馬鈴薯品種的多態性信息Table 3 Polymorphisms revealed by SSR primer in 30 color potato cultivars

圖2 引物STI024對30個彩色馬鈴薯品種PCR擴增的電泳結果Fig.2 Result of electrophoresis of PCR products using STI024 for 30 color potato varieties

通過聚類分析發現，PIC值達到0.9的4對引物擴增出的35條帶能把參試30個品種全部區分開來，說明多態性好的SSR引物適用于大部分馬鈴薯品種的多態性研究。用PIC值達到0.8的19對引物對參試品種進行聚類分析，不僅能把所有30個品種全部區別開，并且19對引物的聚類結果和所有41對SSR引物進行聚類分析的結果高度相似，說明篩選多態性好的SSR引物能更高效地對馬鈴薯品種進行遺傳多態性研究。

2.2 SSR引物檢測的特異性位點分析

在SSR擴增結果中，我們檢測到一些品種和組合特異性的條帶（見表4）。3個特異性條帶STI060-170、STG0010-190和STM0025-150能單一識別品種G06-33-10；條帶STI017-170能檢測品種Atlantic；STI023-120能識別品種Shepody；2個特異性條帶STM0028-150和STM0031-180能檢測來源于CIP的二倍體彩色馬鈴薯資源G06-24-4和G06-33-10；特異性條帶STM1106-145能專一檢測來源于CIP的四倍體彩色馬鈴薯資源G06-36-23和G06-38-2；2個特異性條帶STM1024-220和STM2024-230能從參試品種中檢測出品種1024-1065和1003-329；2個特異性條帶STI048-270和STM1029-140能檢測品種2004-1233和Purple Majesty；條帶STM-

1017-180能檢測品種Purple Valley和1022-8017；STM0028-160能專一檢測來源于CIP的4個彩色馬鈴薯種質G06-36-23、G06-38-2、G06-24-4和G06-33-10；STM1055-190檢測的4個馬鈴薯品種Norland、Russet Burbank、Shepody和 Dermot Lynch均為白肉品種，該條帶可能與馬鈴薯白色薯肉相關。

表4 SSR分子標記檢測到的彩色馬鈴薯品種特異性位點Table 4 Accession and group specific SSR alleles detected in color potato cultivars

2.3 彩色馬鈴薯品種聚類分析

表3顯示SSR引物對30個彩色馬鈴薯品種進行分析的結果，在各個品種中檢測到66～106個等位位點，平均每個品種檢測到92個等位位點。根據檢測的多態性位點，使用UPGMA方法進行聚類分析，分析結果見圖3。參試30個品種在SM=0.65處分為兩個主要聚類群，類群Ⅰ共有23個品種，包括各種顏色馬鈴薯品種，所有品種均為馬鈴薯普通栽培種（S.tuberosum），品種間遺傳相似度較高。類群Ⅰ在SM=0.72處又可以分為5個亞群：亞群Ⅰ.1中除品種All Red為紅色馬鈴薯外，其他均為紫皮紫肉馬鈴薯品種，可視為紫色馬鈴薯品種亞群。亞群Ⅰ.2和Ⅰ.3主要為紅色馬鈴薯品種，9個品種中只有Atlantic和Shepody是白皮白肉，其他均為紅皮紅肉，可視為紅色馬鈴薯亞群；亞群Ⅰ.4和Ⅰ.5共7個品種，其中Norland為紅皮白肉，Northstar、Russet Burbank和Stirling均為白皮白肉，而另外3個彩色馬鈴薯則均為白皮白肉品種雜交后代，其中1003-329為Northstar后代，1014-308和1006-638親本之一為Stirling，因此類群Ⅰ.4和Ⅰ.5可歸為白色馬鈴薯亞群。

圖3 30個彩色馬鈴薯品種的SSR譜帶聚類分析結果Fig.3 Dendrogram of cluster analyses of 30 color potato cultivars by SSR screen

類群Ⅱ共有7個品種，包括參試品種中其他馬鈴薯種質材料，在SM=0.66處分為2個亞群，亞群Ⅱ.1中2004-1233為二倍體野生種S.pinnatisectum和普通栽培種體細胞雜種，G06-24-4和G06-33-10是來自國際馬鈴薯中心的二倍體原始栽培種S.stenotomum的雜交后代。該亞群包括參試品種中所有已知二倍體血緣的試驗材料。亞群Ⅱ.2是來自國際馬鈴薯中心的S.andigena亞種和普通栽培種的雜交后代。

3 討 論

各種不同的分子標記應用于馬鈴薯遺傳多樣性、系統分類以及指紋圖譜建等研究。Grg等用RFLP分子標記鑒定德國馬鈴薯品種[15]；Ghislain等用RAPD分子標記分析馬鈴薯原始栽培種S.phureja的種間變異情況[16]；Kim等使用AFLP分子標記對馬鈴薯品種進行識別[17]；Bornet等用ISSR分子標記比較來源于歐洲和阿根廷馬鈴薯品種的異同[18]。相較于上述各種分子標記，由于SSR分子標記具有多態性好、重復性好和方便利用的優點。本研究使用SSR分子標記對彩色馬鈴薯進行遺傳多樣性研究Milbourne等用3種基于PCR技術的分子標記評價16個馬鈴薯栽培品種多樣性[19]，發現SSR分子標記在分析馬鈴薯品種間遺傳距離時效率更高，并在此基礎上開發了112對SSR引物用于馬鈴薯研究。王紹鵬等對SSR分子標記擴增條件進行優化，并把SSR多重PCR反應體系應用到馬鈴薯分子標記研究中[20-21]。Ghislain等總結的“馬鈴薯遺傳鑒定試劑盒”（Potato genetic identity kit）共包括24對SSR引物，在馬鈴薯12條染色體的每條染色體上分布有2對SSR引物，其對742個馬鈴薯品種識別效率達93.5%[14]。

為更好研究彩色馬鈴薯遺傳多樣性，在以上24對SSR引物基礎上，還收集了文獻報道中多態性、重復性好的SSR引物用于本研究彩色馬鈴薯多態性分析。從聚類分析結果看，馬鈴薯品種聚類分成2個類群，類群Ⅰ全部為普通栽培種，包括大多數彩色馬鈴薯品種和北美栽培面積較大的白色薯肉品種。這些品種根據顏色不同分成3個亞群：紫色品種亞群、紅色品種亞群和白色品種亞群。SSR引物來自遍布馬鈴薯12條染色體的遺傳位點，研究根據遺傳相似度聚類，把彩色馬鈴薯不同顏色品種大致歸類，說明馬鈴薯顏色為多基因控制，色素相關基因位于多條染色體上。同時由于參試彩色馬鈴薯品種多來自于北美，遺傳背景相似，親緣關系較近，因此品種間色素上的差異能被SSR聚類區分開。

類群Ⅱ除了2個北美現有的彩色馬鈴薯品種外，包括了參試品種中其他種質來源的馬鈴薯材料，其中3個來自二倍體種：1個有野生種S.pinnatisectum血緣，2個是原始栽培種S.stenotomum后代。類群Ⅱ的另外2個品種為普通栽培種安第斯栽培亞種（S.andigena）后代，馬鈴薯四倍體種的彩色馬鈴薯性狀主要來種于該亞種，但經多年的農藝性狀改良和定向選擇，使得現代栽培的彩色馬鈴薯品種與安第斯栽培亞種之間的遺傳關系較遠（見圖3）。類群Ⅱ包括二倍體和四倍體的彩色馬鈴薯種質，這些種質代表馬鈴薯品種中顏色性狀的原始來源，在色素表現上和北美彩色馬鈴薯品種相似，但在其他性狀如植株、葉片形狀、塊莖薯形、芽眼深淺等植物學特征上與其他彩色馬鈴薯品種間差異很大。SSR聚類從進化關系上把彩色馬鈴薯種質劃分成兩類，一類為現代的彩色馬鈴薯栽培品種，在農藝性狀，適應性和產量等方面經過改良馴化，適宜現代的馬鈴薯生產加工。另一類則代表了彩色馬鈴薯種質的來源，是彩色馬鈴薯未經改良前的種質資源，這些資源具有更豐富的彩色色素基因，是馬鈴薯品種選育的寶貴種質資源。從聚類關系圖看出，類群Ⅰ中的彩色馬鈴薯品種間親緣關系近，相似度高，遺傳背景相似，彼此間不宜再用作雜交育種的親本配對。而類群Ⅱ不僅與類群Ⅰ的彩色馬鈴薯關系較遠，類群內的種質間來源也不相同，彩色馬鈴薯育種中利用類群Ⅰ和類群Ⅱ彼此進行雜交可以拓展彩色馬鈴薯遺傳背景，提高彩色馬鈴薯新品種選育效率。

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