TRAIL基因多態性與特發性血小板減少性紫癜的相關性研究

張春來，陳曉建，閆曉華，張紀云

(1臨沂市紅十字會中心血站，山東臨沂276000;2山東醫學高等專科學校)

特發性血小板減少性紫癜(ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病，是由抗血小板抗體介導的血小板破壞加速及血小板生成減少的出血性疾病。免疫細胞凋亡是機體免疫調節的重要方式，機體維持免疫系統自穩，避免自身免疫性疾病發生的重要機制。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是一個TNF超家族成員，很多研究發現TRAIL參與免疫細胞對機體的免疫監視，且資料顯示TRAIL在促進免疫細胞凋亡，維持自身免疫耐受等方面有一定作用。根據此特性，我們推斷其與ITP的發生、發展有關，而國內外對TRAIL基因多態性與ITP的相關性研究還未見報道，我們的研究將填補這個空白，為ITP的發病機制及ITP的預防及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究中ITP患者為2008年10月～2011年12月在臨沂市人民醫院、臨沂市中醫院、山東醫專附屬醫院住院及就診的患者，共132例，其中男40例、女92例，平均年齡36.9歲，診斷標準參照《血液病診斷與療效標準》第3版［1］。除外其他引起血小板減少的疾病，且各病例間無遺傳學關系。同時選擇醫院健康查體者做為正常對照組，共130例，其中男40例、女90例，平均年齡39歲，所選對象間均無親緣關系，均山東籍漢族人。

1.2 血液標本的處理和基因組DNA提取 采集兩組對象外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用離心柱法提取基因組DNA(TIANGEN公司)，各取1 μL DNA瓊脂糖凝膠(EB)電泳驗證DNA提取情況。

1.3 設計引物 根據GenBank中TRAIL基因核苷酸序列，設計引物序列，引物序列如下:上游引物5'-AACATCTTCTGTCTTTATAATC-3'，下游引物 5'-AAATAACACGTACTTACTGAAG-3'。擴增后TRAIL目的基因片段為484 bp。PCR擴增體系:上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水21 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，總體積50 μL。反應條件:94℃3 min預變性，然后94℃30 s，48℃ 90 s，72℃45 s，共30個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.4 限制性內切酶酶切PCR產物 PCR產物分別使用兩種酶酶切，取PCR產物用RsaⅠ酶(Fermentas公司)酶切反應，反應體系:PCR產物10 μL，DD Water 16 μL，10×Buffer B 2 μL，RsaⅠ酶1 μL，37℃水浴2 h。另取PCR產物使用TasⅠ酶(Fermentas公司)酶切反應，反應體系:PCR產物10 μL，DD Water 16 μL，10×Buffer B 2 μL，TasⅠ酶1 μL，65℃水浴3 h，酶切產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.5 PCR產物基因測序 隨機取20份PCR產物純化后測序(上海博亞生物技術有限公司)驗證PCR-RFLP法的準確性。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計學分析，基因頻率采用直接計數法，然后確認其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，各基因頻率和等位基因頻率比較用χ2檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 TRAIL基因1525、1595位點等位基因頻率，經χ2檢驗，ITP組和正常對照組符合Hardy-Weinberg平衡定律，期望值和觀察值均無顯著差異(P＞0.05)，達到遺傳平衡，提示所選兩組樣本具備群體代表性。

2.2 基因組DNA提取及PCR擴增結果 經瓊脂糖凝膠電泳分析，所提取的基因組DNA提取成功，純度良好，經PCR擴增后TRAIL目的基因片段為484 bp，瓊脂糖凝膠電泳，條帶整齊且亮，無雜帶，說明擴增成功。

2.3 TRAIL基因1525G/A、1595C/T位點基因型分析 PCR產物經內切酶RsaⅠ酶切，TRAIL基因1525位點檢測到3種基因型:GG基因型(473 bp、11 bp)、AA基因型(286 bp、187 bp、11 bp)和GA基因型(473 bp、286 bp、187 bp、11 bp)，見圖1(雖然11 bp條帶不清楚，但并不影響基因型的判斷)。PCR產物經內切酶TasⅠ酶切，TRAIL基因1595位點檢測到3種基因型:CC基因型(291 bp、193 bp)、TT基因型(291 bp、131 bp、62 bp)和CT基因型(291 bp、193 bp、131 bp、62 bp)見圖2。隨機抽取20例PCR產物測序，基因型分析與酶切結果完全一致。本試驗組 TRAIL基因1525、1595兩位點基因型(GG/CC，GA/CT，AA/TT)和等位基因(G/C，/T)頻率呈現同樣的遺傳變化，同前期試驗結果一致［2］。

2.4 TRAIL基因1525G/A、1595C/T位點基因型和等位基因頻率 TRAIL基因1525、1595位點3種基因型GG/CC、GA/CT、AA/TT在ITP組與正常對照組比較，ITP組1525GG/1595CC基因高于正常對照組，但差異無統計學意義(χ2=2.005，P=0.367); 1525、1595位點等位基因頻率在ITP組和正常對照組無統計學差異(χ2=1.260，P=0.262)，見表1。

表1 ITP組與正常對照組TRAIL基因1525、1595位點基因型和等位基因頻率分布

3 討論

ITP是一種自身免疫性疾病，重者可危及生命，其免疫機制是ITP患者體內產生抗血小板膜蛋白的血小板相關抗體，是血小板被網狀內皮系統或補體系統過度破壞，而引起血小板減少，出現出血臨床表現的疾病。發病機制涉及T細胞、B細胞、細胞因子、細胞受體等多個方面，是多因素共同作用的結果。大量研究表明，ITP的發病主要是在易感基因遺傳基礎上由至今尚未確定的外因如感染等應激因素而誘發的自體免疫反應所致。

TRAIL生物學功能豐富，能介導病變細胞凋亡，還可誘導各種免疫細胞凋亡，被認為是免疫調節因子，可參與機體的免疫調節、免疫自穩和免疫監視，在自身免疫性疾病的發生中具有重要作用［3］。近幾年來TRAIL與免疫性疾病研究較多，如與甲狀腺疾病［4，5］，系統性紅斑狼瘡［6］、類風濕性關節炎［7］等。

目前國內外有關ITP與凋亡因子的研究也有報道，2010年，Yang等［8］研究發現大部分ITP患者巨核細胞數量增加但質量下降，導致血小板數量下降，并且發現ITP患者血清可溶性TRAIL水平下降，提示TRAIL可能與機體免疫耐受有關。2005年，Wang等［9］報道ITP組與正常對照組比較，CD+8T細胞表達FasL和TNF-α明顯增高，而ITP組與正常對照組比較TRAIL表達無統計學差異。本次試驗結果ITP組TRAIL基因第5外顯子3'-UTR區1525/ 1595位點GG/CC基因型頻率比正常對照組增高，但是沒有統計學差異，可能由于TRAIL在參與ITP疾病發生、發展作用不是很重要，也可能與本試驗標本量較少有關，我們將繼續收集標本，采用大樣本、多地域、多民族廣泛協同研究，為ITP的風險估計、預防、診斷及治療提供路徑。

［1］張之南，沈悌.血液病診斷及療效標準［M］.3版.北京:科學出版社，2007:172-173.

［2］Yan X，Xu L，Qi J，et al.sTRAIL levels and TRAIL gene polymorphisms in Chinese patients with fatty liver disease［J］.Immunogenetics，2009，61(8):551-556.

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［5］Kandror VI，Krainova SI，KriukovaⅣ，et al.On the mechanisms of thyrocyte proliferation and death in autoimmune thyroid diseases［J］.Vestn Ross Akad Med Nauk，2006，(9-10):56-61.

［6］王丕明，趙培慶，續力云，等.TRAIL基因多態性與系統性紅斑狼瘡的相關性研究［J］.免疫學雜志，2010，26(9):789-792.

［7］Xie YD，Jin L，Yu QW.The role of IFN-γ，IL-10，IL-12 and TRAIL in sera and synovium fluids from patients with rheumatoid arthritis［J］.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhil，2007，23(6): 536-537

［8］Yang L，Wang L，Zhao CH，et al.Contributions of TRAIL-mediated megakaryocyte apoptosis to impaired megakaryocyte and platelet production in immune thrombocytopenia［J］.Blood，2010，116 (20):4307-4316.

［9］Wang L，Zhang F，Zhu Y，et al.Mechanism of cell-mediated lysis of autologous platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2005，85(43):3048-3051.