缺氧對大鼠心肌細胞系H9C2中HIF-1α、CT-1表達的影響

王 晗，符史干，董戰玲，許閩廣，王 楊，陳國斌，高凌峰

(海南醫學院生理學教研室，海口571101)

缺氧誘導因子(HIF-1)是哺乳動物細胞在缺血/缺氧情況下產生的一種核轉錄因子，可促進下游缺氧反應基因如促紅細胞生成素(EPO)、血管內皮生長因子(VEGF)、細胞周期素G2、血紅素氧合酶-1 (HO-1)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達，增強組織細胞抵抗缺血、缺氧的能力［1，2］。HIF-1由α亞基和β亞基組成，其中對HIF-1活性的調節主要通過α亞基。心肌營養素-1(CT-1)是新近發現的一種細胞因子，屬于 IL-6超家族，可通過 JAK/ STAT3、MAPK-MEK/ERK、PI3-K/Akt等信號途徑發揮保護心肌細胞的作用。缺氧時HIF-1與CT-1的關系尚不清楚，2010年1月～2011年4月我們檢測了缺氧時大鼠心肌細胞系H9C2中HIF-1和CT-1的表達情況，從而為探討缺血心肌中HIF-1與CT-1的關系提供方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基、TRIzol購自Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購自廣州研創生物技術發展有限公司;HIF-1α抗體，CT-1抗體，actin抗體購自Santa Cruz公司;PCR相關試劑購自博大泰克公司;氯化鈷(CoCl2)購于海南青鳥生物科技有限公司;大鼠心肌細胞系H9C2購自上海越研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與低氧孵育 大鼠心肌細胞系H9C2使用DMEM培養液(加入10%胎牛血清)，放置于37℃、5%CO2孵箱中。低氧環境通過在培養基中加入CoCl2實現。

1.2.3 細胞活性檢測 H9C2細胞活性通過CCK-8試劑盒檢測。種植于96孔板的細胞，按照每孔100 μL培養基加入10 μL CCK-8溶液的比例進行孵育，2 h后檢測OD450。

1.2.4 HIF-1α及 CT-1 mRNA檢測 Real-time PCR法檢測缺氧前后H9C2細胞中HIF-1α和CT-1的基因水平。CoCl2處理H9C2細胞48 h后提取RNA檢測HIF-1α和CT-1的基因表達量。細胞總RNA提取采用TRIzol試劑提取法，具體方法參照說明書。RNA經逆轉錄反應合成 cDNA，Real-time PCR擴增過程及熒光信號檢查、數據的儲存和分析均由儀器(ABI Prism 7300 sequence detection system)及自帶的SDS軟件自動完成。actin作為內對照來評估HIF-1和CT-1 mRNA的表達。

1.2.5 HIF-1α及CT-1蛋白檢測 Western blot法檢測缺氧前后H9C2細胞中HIF-1α和CT-1的蛋白表達量的變化。CoCl2處理48 h后收集細胞，冷PBS洗滌，加入細胞裂解液各200 μL，經8%SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜，蛋白封閉液4℃封閉膜過夜;加入鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶500)，室溫搖床孵育2 h，應用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠多克隆抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h，再加入化學發光顯色劑顯色，X光片曝光顯影，凝膠成像分析系統掃描。CT-1蛋白水平檢測方法同HIF-1。actin作為內對照。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5軟件包對實驗數據進行統計學處理，配對組間比較采用t檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 使用CoCl2后H9C2細胞的增殖情況 對照組(培養液中無CoCl2)模擬缺氧第1、2、3、4天后的OD值分別為0.220±0.007、0.350±0.055、0.670 ±0.060、0.870±0.053，缺氧組(培養液中加入100 μmol/L的CoCl2)分別為0.220±0.014、0.360± 0.028、0.530±0.047、0.700±0.051。對照組和缺氧組OD值都呈上升趨勢，加CoCl2模擬缺氧第1、2天后OD值與對照組無統計學差異(P＞0.05)，加CoCl2第 3、4天后 OD值較對照組降低(P均＜0.05)。

2.2 HIF-1及CT-1 mRNA表達 缺氧組和對照組H9C2細胞中HIF-1α mRNA都有表達(分別為2.90 ×10-3±0.000 5和2.72×10-3±0.000 6)，但缺氧時HIF-1α mRNA較對照組無明顯差別(P＞0.05)。CT-1 mRNA在常氧和缺氧條件下也都有表達(分別為3.48×10-4±0.000 08和6.19×10-4±0.000 07)，但缺氧后CT-1 mRNA水平增高(P＜0.05)。

2.3 HIF-1及CT-1蛋白表達 Western blot結果顯示，對照組即常氧情況下HIF-1α蛋白幾乎沒有表達，缺氧后HIF-1α蛋白表達增加(P＜0.05)。CT-1蛋白在常氧和缺氧條件下也都有表達，缺氧后CT-1蛋白水平明顯增高(P＜0.05)，見圖1。

圖1 模擬缺氧后H9C2細胞中HIF-1α及CT-1蛋白表達

3 討論

在全世界范圍內缺血性心臟病的發病率和病死率逐年攀升，盡管目前經皮冠狀動脈介入術等治療已得到廣泛應用，部分患者仍無法完全重建血運。研究者們努力尋找新的治療靶點。心肌缺血會導致心肌缺氧，在體外，缺氧的環境可以通過使用低氧孵箱和使用CoCl2來實現［3］。本研究采用向培養液中加100 μmoL/L CoCl2模擬缺氧。結果顯示CoCl2模擬的缺氧環境使心肌細胞系H9C2存活率較常氧時下降。

氧是機體維持生存的必要因素，整體或局部缺氧會引起機體產生一系列適應性反應，這些反應與缺氧誘導產生的HIF-1密切相關，HIF-1作為一種轉錄因子可調節一系列基因的轉錄，從而維持機體的功能［4］。HIF-1的 α和 β兩個亞單位都屬于bHLH-PAS轉錄因子家族。細胞內氧的水平能夠調節α亞單位的穩定性、亞細胞定位和其促轉錄的功能;而β亞單位在細胞核中持續表達，其活性不受缺氧的影響。α和β亞單位結合后才能發揮促進基因轉錄的作用。在常氧情況下，α亞單位能通過腫瘤抑制蛋白介導的泛素—蛋白酶途徑被迅速降解，而缺氧能阻斷這一途徑，使HIF-1α單位穩定下來［5，6］。因此，本研究中向培養液中加100 μmol/L CoCl2模擬缺氧后，H9C2細胞中HIF-1α的蛋白水平增加，而HIF-1α的mRNA水平與常氧比較沒有變化，這與理論上保持一致。據研究表明，HIF-1在心肌缺血時主要通過促進EPO、VEGF、HO-1、iNOS等基因的表達發揮代償作用［7］。除此之外，在心肌缺血缺氧時，HIF-1是否還可以通過促進其他與心肌保護密切相關因子的表達發揮代償作用，值得探討。

CT-1是1995年Pennica等［8］從小鼠心臟發育的胚胎干細胞中克隆表達出的一種因子，為白細胞介素6細胞因子家族的新成員，因其在體外能夠導致心肌細胞肥大而得名［9］。CT-1除可促使心肌細胞肥大外，還有促進心肌細胞存活的作用［10］。近年來，CT-1在心肌受損保護方面的作用受到廣泛的關注。CT-1在心肌缺血缺氧情況下表達增加，發揮心肌保護作用，其調控機制是什么，目前尚不明確。有研究表明CT-1在小鼠胚胎細胞中受HIF-1的調控［11］，但在缺氧的心肌細胞中CT-1是否受到HIF-1的調控尚未闡明。本研究結果顯示CoCl2模擬缺氧后大鼠心肌細胞系H9C2中CT-1 mRNA和蛋白水平都增加，伴隨著HIF-1蛋白水平的增加而增加，提示在缺氧心肌中HIF-1與CT-1可能存在一定的關系。在缺氧心肌中，缺氧會誘導心肌細胞中HIF-1α蛋白增加，HIF-1α和 HIF-1β結合可能通過促進CT-1基因的轉錄來促進CT-1蛋白的表達。但心肌缺氧時CT-1是否確實受HIF-1的調控，還有待于進一步研究。

本研究為缺氧情況下心肌的代償機制提供新的見解和實驗資料，對揭示缺氧情況下心肌細胞自身調控有重要的生物學意義，對治療缺血性心臟病提供新的思路和重要的實驗佐證。

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