曲古抑菌素A對甲狀腺鱗癌SW579細胞株p53和p21表達的影響

劉 超，趙 頌，張秀梅，王翠瑤，劉 洋，肖建英

(遼寧醫學院，遼寧錦州121001)

組蛋白去乙酰化酶抑制劑的應用標志著一種全新的腫瘤治療途徑。曲古抑菌素A(TSA)是一種高效、低毒的化療新藥，可通過多種途徑發揮其抗癌效應，在體內外可阻滯多種腫瘤細胞株的生長，誘導分化及凋亡，但抗腫瘤的具體機制尚不清楚［1～4］。2010年10月～2011年7月，本研究通過選用不同濃度的TSA作用于甲狀腺鱗癌SW579細胞株，旨在探討TSA對甲狀腺鱗癌SW579細胞株生長增殖及細胞周期蛋白p53與p21表達的影響，進而探討TSA的抗癌機制，為TSA的臨床開發應用提供詳實的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 TSA、L15培養液(Sigma公司);RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒(TaKaRa公司);p53(兔抗人多克隆抗體)、p21(小鼠抗人多克隆抗體)、β-Actin抗體(兔抗人多克隆抗體)購自Santacruz公司;Western細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術公司;HRP標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司); ECL化學發光試劑盒(Piece Biotechnology公司);四甲基氮唑蘭(Sigma公司);BB16UV CO2培養箱(Heraeus);Sunrise自動酶標檢測儀(Tecan公司); BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀、PCR擴增儀購自Eppendorf公司;水浴式電轉印槽DYY-Ⅲ40B型(北京六一儀器廠)，凝膠自動成像儀GDS8000、電泳儀、電泳槽(Bio-Rad，美國)。

1.2 細胞培養及實驗分組 甲狀腺鱗癌細胞株SW579購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。培養基為L15，含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，在飽和濕度、37℃、無CO2孵箱中培養，當細胞匯合至培養瓶底面積80%左右時進行傳代培養。當細胞處于對數生長期時，以1×105個/mL濃度接種于25 cm2的培養瓶中或96孔培養板中。24 h后待細胞貼壁后給藥，TSA組終濃度分別為50、100、200、400 nmol/L，DMSO組加入5 μL DMSO［DMSO濃度小于0.1%(V/V)］，此濃度對細胞生長無影響。

1.3 MTT法檢測細胞生長抑制率 取對數生長期細胞，以1×105個/mL接種于96孔板上，每孔200 μL，培養24 h后，分別加入不同濃度的TSA，各濃度組6復孔。培養48 h后，加入20 uL MTT(5 mg/ mL)孵育4 h。棄去培養液，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩15 min，使沉淀物充分溶解。用酶標儀490 nm測吸光度值(A值)，測定細胞生長抑制率。公式如下:抑制率=1－加藥組A值/對照組A值×100%。

1.4 RT-PCR方法檢測p53、p21 mRNA表達 采用TRIzol一步法提取細胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用RNA PCR(AMV)Ver3.0試劑盒，按操作步驟進行逆轉錄和PCR。反轉錄條件42℃，30 min;99℃，5 min;5℃5 min。PCR引物序列:p53(5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3'，5'-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3'，292 bp);p21(5'-GGATGTCCGTCAGAACCCA-3'，5'-CAGGTCCACATGGTCTTCC-3'，399 bp);β– actin (5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'，5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'，661 bp)。循環條件:94℃預變性5 min;94℃30 s; p53 55.3℃;p21 58.5℃ 30 s;72℃ 50 s;30個循環;72℃終延伸10 min。取PCR產物10 μL進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應用EDAS290凝膠成像分析系統進行灰度測量。

1.5 Western blot方法檢測p53、p21的蛋白表達用蛋白裂解液提取對數生長期細胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度，－20℃或－80℃保存備用。電泳前，加入2×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，之后用含5%BSA的TBS(pH 7.4)將濾膜于室溫搖動溫育2 h進行封閉，封閉后的濾膜再分別與p53、p21抗體(稀釋比為1∶200)、β-actin(稀釋比為1∶1 000)4℃溫育過夜。經TTBS洗滌后，HRP偶聯的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000)室溫溫育2 h，洗膜后，使用ECL發光法顯色。內參采用β-actin。計算機軟件Image J進行密度分析，計算灰度值。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，各組數據以s表示，多樣本均數檢驗采用方差分析，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長抑制率檢測結果 SW579細胞經不同濃度TSA(0、50、100、200、400 nmol/L)分別作用下，各組細胞抑制率隨著藥物濃度的升高而升高(P＜0.01)，分別為0、23.58%、32.39%、42.83%、74.03%，說明TSA各濃度組均可抑制細胞生長，且呈劑量依賴性。

2.2 RT-PCR結果 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳灰度測量分析表明，未加TSA組p53(0.190±0.002)，p21(0.239±0.004)表達量較低。DMSO組p53 (0.216±0.001)，p21(0.203±0.003)與未加TSA組比較差異無統計學意義。與未加TSA組比較，TSA在(50～400 nmol/L)濃度范圍內p53的mRNA表達水平無明顯提高，分別為0.212±0.001、0.211 ±0.001、0.249±0.001和0.268±0.001，且各組間無顯著性差異(P＞0.05)。而在TSA各濃度組p21的mRNA表達水平顯著提高，且TSA在(50～400 nmol/L)濃度范圍內灰度值分別為0.338±0.003、0.410±0.004、0.448±0.001和0.579±0.004，且有劑量依賴性。結果見圖1、2。

2.3 Western blot結果 蛋白定量分析表明，未加TSA組p53(0.055±0.004)，p21(0.287±0.004)表達量較低;與未加TSA組比較，TSA在(50～400 nmol/L)濃度范圍內p53的蛋白表達水平明顯提高，分別為0.146±0.008、0.267±0.004、0.298± 0.007和0.518±0.008，各組與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。而TSA各濃度組隨著TSA濃度的增加，p21蛋白表達量逐漸增多，且TSA在50～400 nmol/L濃度范圍內灰度值分別為0.338±0.003、0.410±0.004、0.448±0.001和0.579±0.004，各組與未加TSA組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)。結果見圖3。

圖3 SW579細胞經TSA處理后p53、p21蛋白的表達

3 討論

TSA，以前被鑒定是抗真菌藥物，抑制去乙酰化酶的活性。組蛋白乙酰化介導的轉錄有利于轉錄因子結合核DNA［5］，表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠促進p53依賴的下游基因Bax和p21waf1/Cip1的轉錄，結合p53基因轉移比單獨的p53基因轉移更能有效地誘導細胞凋亡［6］。本實驗結果表明，經50～400 nmol/L的TSA作用48 h后，TSA對SW579細胞的增殖均有顯著的抑制作用，并呈劑量依賴效應。p53基因是重要的抑癌基因，野生型p53是細胞生長重要的負調節基因，維持細胞正常分化，抑制細胞增殖及癌變，同時也可誘導細胞凋亡。當DNA損傷或突變時，野生型p53積累，上調其下游p21靶基因表達［7］。本實驗結果顯示，TSA各濃度組作用SW579細胞之后，p53的mRNA水平變化不明顯，蛋白表達水平隨著濃度的增高顯著上調，p53的mRNA水平未呈現與其蛋白水平一致的變化趨勢，說明TSA可能通過調節p53的穩定性發揮作用。Nakajima等［6］報道250 nmol/L TSA作用于乳腺癌細胞株MDA-MB-231后對p53的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比無明顯差異。Sowa等［8］證明骨肉瘤細胞系MG63中TSA通過Sp1位點以p53非依賴的途徑誘導p21WAF1/CIP1的轉錄激活，這與Li等［4］得出的TSA處理HeLa細胞時p53的表達改變的結論有所不同，分析可能由于不同實驗室中細胞株由于較長時間培養基因背景發生改變所致，原因有待進一步分析。在何種情況下p53能夠被TSA誘導表達并激活參與下游分子活性的調節是我們下一步的研究內容。

p21基因是p53基因的下游基因，在功能上繼承了p53基因的抑癌作用，因此，p21作為抑癌基因是細胞周期重要的調控因子［9］。本實驗結果顯示，TSA各濃度組作用SW579細胞之后，p21的mRNA和蛋白表達水平顯著上調，且隨著TSA濃度的增大而增加，呈現劑量依賴性效應。Greenberg等［10］研究表明，TSA能抑制甲狀腺癌ATC細胞株生長、促進其凋亡，阻滯細胞周期于G1和G2/M期，同時增加p21WAF1/CIP1及p27Kip1的表達，抑制Cyclins A、B的表達。本研究結果與上述報道一致，提示TSA抑制甲狀腺鱗癌SW579細胞增殖的作用與上調p21表達水平有關。因此我們的研究認為TSA誘導內源p53表達增加時，增加的p53極可能通過直接作用于p21 WAF1/CIP1啟動子上其效應元件而增強p21 WAF1/CIP1的表達，從而在TSA通過Sp1途徑誘導p21 WAF1/CIP1轉錄激活中發揮協同作用，表明乙酰化修飾極可能是這些細胞系中p21 WAF1/CIP1表達沉默的分子基礎。關于TSA對SW579細胞株的詳細作用機制，本實驗室仍在進一步研究之中。

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