IDO基因轉染宮頸癌細胞SiHa在體外抑制NK細胞殺傷作用的研究

王冬冬，霍乃晨，王曉黎，張淑蘭

(1中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004;2中國醫科大學附屬第一醫院)

宮頸癌發病率在女性惡性腫瘤中占第2位［1］。常規的治療方法是手術或者放療，以及手術和放療相結合的綜合治療。另外，許多醫療機構將對根治術后患者實行新輔助化療作為常規治療［2］。但仍有相當一部分患者存在術后復發和遠處轉移。因此，尋求手術、放療、化療之外的基因靶向治療和免疫治療方法是目前探索宮頸癌治療方法的新方向。IDO是色氨酸經由犬尿氨酸代謝途徑中第一步中的限速酶，IDO過度表達可導致色氨酸缺乏和其代謝產物蓄積。色氨酸缺乏可使細胞毒T細胞和NK細胞數量減少［3］，色氨酸代謝產物蓄積可使NK細胞殺傷功能減弱［4］，從而產生腫瘤免疫耐受。腫瘤免疫耐受和宮頸癌的發生發展密切相關。本研究通過IDO基因轉染至宮頸癌細胞SiHa，研究IDO在體外對NK細胞的殺傷作用的影響，從而證明了IDO可以作為宮頸癌基因治療的潛在新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 宮頸癌細胞株SiHa培養于含10%的小牛血清、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5%CO2的條件下培養。

1.2 基因轉染 用標準的磷酸鈣沉淀方法將IDO基因表達載體pcDNA3.1-IDO［5］和空白對照載體pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)轉染宮頸癌細胞SiHa，經抗生素篩選后得到IDO穩定表達的Si-Ha/IDO細胞株和SiHa/Mock對照細胞株。

1.3 轉染細胞的IDO蛋白表達測定 選擇耐藥克隆株應用Western blot檢測IDO和內參β-actin蛋白表達。待3種細胞(SiHa，SiHa/Mock和SiHa/IDO)的細胞匯合度達到95%時，收集細胞，NP-40裂解液裂解后，離心后取上清，檢測蛋白濃度(BioRad protein assay kit，Veemendaal，the Netherlands)，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉至PVDF膜上。1%脫脂奶粉封閉1 h，抗人IDO抗體(TBST溶液1∶1 000稀釋)孵育過夜，TBST沖洗3次，二抗(TBST溶液1∶1 000稀釋)孵育1 h，TBST沖洗3次后，曝光顯影。PVDF膜經蛋白剝離液洗脫后，1%脫脂奶粉封閉，用抗β-actin抗體重復上述步驟。

1.4 細胞生長曲線測定 應用MTT試劑盒，每孔100個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200 μL，將培養板移入CO2孵箱中，在37℃培養，每24 h在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.5 在體外腫瘤細胞對NK細胞殺傷作用敏感性的檢測 用MTT試劑盒檢測體外腫瘤細胞對NK細胞殺傷作用的敏感性。將3種腫瘤細胞(SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO)500個分別接種于96孔細胞培養板，同時加入KHYG-1細胞［6］(分別0、500、1 000、2 000個)，在含有10%小牛血清的DMEM/ F12培養基中37℃共同培養72 h。PBS沖洗培養板3次，徹底清除KHYG-1細胞，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以效應細胞與靶細胞比值(E/T)為橫軸，光吸收值為縱軸繪制存活細胞的百分比變化曲線。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，實驗結果以s表示，組間比較采用組間Student’s t檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IDO蛋白表達 IDO蛋白在SiHa/IDO細胞中表達陽性，在SiHa和SiHa/Mock細胞中無表達，見圖1。

2.2 腫瘤細胞體外生長曲線測定 3組腫瘤細胞(SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO)在體外生長速度無明顯差異(P＞0.05)，見圖2。

2.3 體外腫瘤細胞對NK細胞殺傷作用敏感性的檢測 見圖3。SiHa/IDO細胞存活的百分比高于其他兩組對照(SiHa和SiHa/Mock)細胞，P＜0.05。

圖3 腫瘤細胞和NK細胞共同培養后存活細胞的百分比變化曲線

3 討論

IDO是細胞內一種含亞鐵血紅素的酶，廣泛分布于人和其他哺乳動物除肝臟以外的其他組織中，是肝臟以外惟一可催化色氨酸經由犬尿氨酸途徑進行分解代謝的限速酶，可以將色氨酸分解為L-犬尿酸、吡啶甲酸和喹啉酸等多種代謝物。正常情況下IDO在體內呈低水平表達。由于色氨酸是細胞維持活化和增殖所必需的氨基酸，同時也是構成蛋白質必不可缺的重要成分，它的存在對各種細胞維持其正常功能非常關鍵。如果IDO的活性表達異常增高，會導致細胞微環境中色氨酸的耗竭，細胞便會失去正常的功能，生長緩慢甚至凋亡。T細胞和NK細胞對此尤其敏感，因此IDO升高所致的色氨酸缺乏會導致T細胞和NK細胞數量減少［3］，色氨酸代謝產物的蓄積會通過抑制NK細胞受體的作用，從而抑制NK細胞的細胞殺傷作用［4］，由此產生腫瘤的免疫抑制。Uyttenhove等［7］首次報道了IDO在人腫瘤組織中有表達，其中包括:前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌等，婦科腫瘤中，IDO在宮頸癌、卵巢癌和子宮內膜癌組織中均有表達。有研究報道IDO可作為宮頸癌判斷預后的指標［8］。

本研究應用IDO基因表達載體pcDNA3.1-IDO穩定轉染宮頸癌細胞SiHa，獲得了IDO高表達宮頸癌細胞SiHa/IDO。體外細胞增長曲線顯示，高表達的IDO對宮頸癌細胞體外生長速度未產生影響。而體外腫瘤細胞對NK細胞殺傷作用敏感性檢測結果提示SiHa/IDO細胞對NK細胞殺傷作用的敏感性低于其他兩組對照腫瘤細胞(SiHa和 SiHa/ Mock)，證實了IDO升高所致的色氨酸代謝產物的蓄積抑制了NK細胞的殺傷作用。另一方面，血管生成作用也是腫瘤生長和轉移的一個重要因素，但目前為止，關于IDO與血管生成作用關系的研究還十分有限。因此，進一步進行體內試驗觀察IDO對于血管生成，比如說腫瘤內新生血管數量的對比十分必要。

綜上，本研究通過體外試驗證明了IDO參與了宮頸癌的生長進程，過表達IDO可以抑制NK細胞的殺傷作用，并可以此作為一個理論基礎進行進一步的體內試驗，研究這一宮頸癌基因治療的潛在新靶點。

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