Livin、Caspase-3和PCNA在子宮頸鱗狀細胞癌癌變中的表達及意義

毛麗梅 王向紅 李麗華 李翠芹 王文立 王亞凡

Livin作為凋亡抑制基因，它的異常表達使細胞的正常凋亡機制受損，從而導致有惡變潛能的細胞積累，進而導致腫瘤的發生、發展。Livin含有IAPs家族成員特有的BIR和RING指結構域，它與Caspases蛋白結合，抑制其介導級聯激活反應引起細胞凋亡，Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，全部或部分負責大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性或拮抗其功能可使細胞凋亡受抑。由于Livin能夠在一些腫瘤中特異性高表達，因此研究其結構和功能為抗腫瘤藥物篩選、癌癥的治療有重要意義。目前，筆者見到的國內有關Livin在正常宮頸鱗狀上皮、宮頸上皮內瘤變、宮頸鱗癌中的表達情況報道很少，且Livin、Caspase-3和PCNA在宮頸鱗癌癌變發生發展過程中的作用尚不清楚。本研究擬以免疫組化法探討正常宮頸鱗狀上皮、宮頸上皮內瘤變、宮頸鱗癌中Livin、Caspase-3和PCNA的表達情況，以期進一步探討宮頸鱗癌的發病機制，為宮頸鱗癌的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集 選擇我院2004至2010年存檔蠟塊。其中正常宮頸鱗狀上皮22例，宮頸上皮內瘤變(CIN)75例，宮頸鱗癌42例(其中高中分化22例、低分化20例;年齡＜50歲29例，≥50歲13例;腫瘤直徑≥3 cm者18例，＜3 cm者24例;臨床分期:Ⅰa～Ⅰb期30例，Ⅰa～Ⅱb期12例;有淋巴結轉移者8例，無淋巴結轉移者34例)。

1.2 方法 由2位有經驗的病理醫師對全部病例的所有切片進行復查。CIN分級按WHO腫瘤病理與遺傳學分類［1］，組織學分級(按Broder的宮頸癌分類標準分級［2］)、臨床分期(按1995年FIGO分期［3］)的標準進行診斷。采用免疫組化法，一抗為鼠抗人Livin單克隆抗體(美國Imgenex公司生產)，工作濃度均為1∶150。實驗步驟按試劑盒說明書進行。將已知的乳腺癌切片作為陽性對照，陰性對照以PBS替代一抗。

1.3 結果判定 按照半定量積分方法，每例均隨機觀察5個高倍視野(×400)，進行半定量積分判斷結果:陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為 3分，＞75%為4分;陽性強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將細胞陽性率與染色強度兩者積分相乘:0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 15.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗及相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Livin在子宮頸鱗狀細胞癌中的表達與腫瘤分化程度密切相關，高、中分化鱗癌組織Livin陽性表達率明顯低于低分化鱗狀細胞癌(χ2=6.453，P＜0.05)。Livin的表達與淋巴轉移有關，有淋巴轉移的宮頸鱗狀細胞癌的Livin的陽性表達率明顯高于無淋巴轉移(χ2=3.953，P＜0.05)。而與年齡、腫瘤大小、臨床分期無相關關系(P＞0.05)。Caspase-3在宮頸鱗狀細胞癌中的表達與腫瘤分化程度密切相關，高中分化鱗癌組織Livin陽性表達率明顯高于低分化鱗狀細胞癌(χ2=7.832，P＜0.05)。而與年齡、腫瘤大小、臨床分期及淋巴轉移無相關關系(P＞0.05)。PCNA在宮頸鱗狀細胞癌組和CIN組PCNA的陽性表達明顯高于正常組，但其表達與年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期及淋巴轉移均無關(P＞0.05)。見表1。

表1 Livin、Caspase-3和PCNA在宮頸鱗癌中的表達及與臨床病理參數的關系 例

3 討論

凋亡抑制蛋白是一類內源性細胞凋亡抑制因子，在很多物種中起著抑制凋亡的作用，其過度表達引起細胞凋亡不足與腫瘤的發生發展密切相關。Livin基因是一種新發現的IAP成員［4］，基因位于人染色體20 q13.3，全長4.6 kb，包含7個外顯子及6個內含子，其基因轉錄產物有2種mRNA亞型，分別編碼298個氨基酸蛋白質(α)和280個氨基酸蛋白質(β)，Livin蛋白N端僅包含一個BIR結構，C端含一個RING環指結構。Livin基因只在黑色素瘤、結腸癌、前列腺腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、非小細胞肺癌(NSCLC)等腫瘤細胞中及在胎盤、胚胎組織中表達，在多數正常成人組織中不表達。這一表達的特異性使得Livin基因成為目前國際研究的熱點［5］。

Livin蛋白主要表達于細胞質［6］。而Ka等［7］對胎盤、滋養層細胞和絨毛膜癌細胞系染色，陽性顯色僅定位于胞核。Vucic等［8］研究發現Livin在細胞中主要表達于胞質而不是紡錘體上，但Kasof等［9］認為Livin細胞分布與Survivin相似，即可在胞質和胞核內呈纖維絲狀表達，本實驗中其陽性顯色位于腫瘤細胞的胞質和核內，這與Kasof等［9］結果是一致的。

Livin抑制細胞凋亡作用主要通過其BIR區(位于Livin的86至154氨基酸處)與半胱氨酸蛋白水解酶(Caspases家族)結合，抑制其活性，與Caspases蛋白家族中的多個成員相互作用，尤其是Caspases3/-7和Caspases-9的活性，阻止Caspase蛋白在細胞凋亡時執行蛋白切除功能，達到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎的凋亡途徑而起作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，全部或部分負責大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性或拮抗其功能可使細胞凋亡受抑，說明Caspase-3對細胞凋亡是必需的。本實驗表明Livin蛋白在正常子宮頸鱗狀上皮、CIN和子宮頸鱗狀細胞癌3組中表達呈遞增趨勢，而 Caspase-3蛋白呈遞減趨勢。這說明 Livin和Caspase-3在宮頸鱗癌發生、發展中的起著重要作用。Livin與Caspase-3的宮頸鱗癌中表達呈負相關(P＜0.05)，這證實Livin可通過對誘發凋亡的效應性蛋白酶Caspase-3有直接抑制作用。在細胞中Livin蛋白將Caspase-3牢固地連接在中心粒上，而使Caspase-3無法發揮蛋白水解的催化功能。凋亡途徑因此失去重要的酶，而無法進行凋亡酶依賴的凋亡。

本結果顯示，子宮頸鱗狀細胞癌中Livin陽性表達率明顯高于正常組(P＜0.05)，但正常宮頸組織無Livin蛋白表達。提示Livin可以作為宮頸癌的一種標志物，這不僅有助于宮頸癌的診斷，而且可以為宮頸癌的生物治療提供依據。另外，Livin表達與腫瘤分化程度密切相關，隨宮頸癌分化程度降低，Livin表達率呈增高趨勢，有淋巴轉移者其陽性表達率高于無淋巴轉移，差異有統計學意義(P＜0.05);說明宮頸癌組織惡性分化程度與Livin的表達有關;與PCNA的表達呈正相關(P＜0.05)，進一步從側面說明了凋亡抑制基因Livin在抑制宮頸癌細胞凋亡及促進增殖中的作用。Livin在一些腫瘤中的特異表達及其功能，為一些惡性腫瘤的檢測提供新的分子標志物。亦成為抗腫瘤治療的新靶點，目前人們已經能夠在基因水平上干預基因表達失調所致的疾病，特別以mRNA作為靶標的反義藥物，可以減少和消除有害基因的表達，達到治療疾病的目的。因此，通過直接阻斷Livin與目的分子的結合，可以加速腫瘤細胞凋亡，為腫瘤治療提供新的途徑。這些預示著Livin可作為新腫瘤抗原來檢測這些腫瘤，并可能成為腫瘤治療上有前途的分子靶點。然而這些方法目前還僅僅停留在實驗階段，而且大都是體外實驗，還有待進一步的臨床實驗來證實，相信對Livin的進一步研究能夠為腫瘤的治療提供行之有效的新途徑。

1 WHO腫瘤病理與遺傳學分類，女性生殖器官腫瘤(2003).診斷病理學雜志社，2006.123-125.

2 回允中主譯，Stanley J主編.女性生殖道病理學.第1版.北京:北京大學醫學出版社，2005.209.

3 劉彤華主編.診斷病理學.第1版.北京:人民衛生出版社，2006. 512.

4 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a navel member of the inhibitor of apoptosis protein family.Biochem Biophys Res Commun，2000，279:820-831.

5 Gzzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin，Survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer.Ann Oncol，2003，14:85-90.

6 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas.Curr Biol，2000，10:1359-1366.

7 Ka H，Hunt JS.Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas.Am J Pathol，2003，163:413-422.

8 Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al.SMAC negatively regulates the Antiapoptotic activity ofmelanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP).J Biol Chem，2002，277:12275-12279.

9 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member.J Biol Chem，2001，276:3238-3246.