腺病毒介導siRNA抑制全反式維甲酸誘導的骨髓間充質干細胞RARβ表達

畢楊，龔敏，何昀，張赟，陳潔，李廷玉

重慶醫科大學附屬兒童醫院 兒童營養研究中心 兒童發育疾病研究省部共建教育部重點實驗室，重慶 400014

全反式維甲酸 (All-trans retinoic acid，ATRA) 是目前公認的能有效誘導干細胞分化的重要因子，它是維生素A在體內的重要活性代謝產物，多項研究證實ATRA及其信號通路廣泛參與了胚胎期和生后早期神經細胞分化、軸向對稱生長等神經系統發育過程[1]。ATRA主要通過細胞核膜上的維甲酸受體 (Retinoic acid receptor，RAR) 介導信號轉導，影響下游基因的轉錄調控從而發揮其生物學效應[2]。RARs包含由不同基因編碼的α、β與γ 3個亞型，其中RARβ是一種在神經細胞特異表達的受體，對神經元表型的決定和維持有重要作用[3]。前期結果顯示，骨髓間充質干細胞 (Mesenchymal stem cells, MSCs) 中幾乎不表達 RARβ，而 ATRA預處理可以增強RARβ的表達，促進骨髓間充質干細胞定向成神經分化[4]，提示RARβ可能是維甲酸信號轉導途徑參與MSCs成神經分化的重要因素。siRNA沉默技術是研究信號轉導通路的重要技術方法[5]，本研究構建并篩選出攜帶針對大鼠RARβ基因的siRNA重組腺病毒，感染 MSCs后能有效抑制ATRA誘導的 RARβ表達增高，為進一步探討RARβ是否參與維甲酸信號轉導途徑調控的MSCs成神經分化作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

腺病毒穿梭質粒pSES-HUS、攜帶腺病毒骨架質粒pAd-Easy1的大腸桿菌BJ5183 (美國芝加哥大學何通川教授饋贈)；大腸桿菌 DH5α、HEK293細胞 (本實驗室保存)；大鼠MSCs為本實驗室分離培養，內切酶SfiⅠ、PmeⅠ、PacⅠ(Biolabs公司)；T4 DNA連接酶、RT-PCR試劑盒、PCR Premix、Real-time PCR Master Mix (TaKaRa公司)；DNA marker、質粒抽提試劑盒(Promega公司)；LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)；DMEM培養基、胎牛血清 (HyClone公司)；兔抗大鼠RARβ多克隆抗體、兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶 (Neuron-specific enolase，NSE) 抗體 (Abcam 公司)；羊抗大鼠巢蛋白(Nestin) 抗體、小鼠抗大鼠 β-微管蛋白(β-tubulin, Tju1) 抗體、小鼠抗大鼠 β-肌動蛋白(β-actin) 抗體、HRP標記的羊抗兔二抗 (Santa Cruz公司)；Dylight488標記的羊抗兔、羊抗小鼠、驢抗羊二抗 (Jackson Immunor Research公司)；PCR引物 (Invitrogen公司合成)；基因測序由重慶醫科大學感染病重點實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 pAd-siRARβ腺病毒載體的構建

設計 4對大鼠 RARβ基因的 siRNA序列(表1)，體外退火 (10 mmol/ L各10 μL混合，100 ℃，10 min，自然冷卻至室溫) 成兩端有SfiⅠ酶切位點的雙鏈DNA，SfiⅠ酶切pSES-HUS質粒，與退火片段16 ℃連接4 h，連接產物電轉大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性篩選單克隆，抽提質粒，PCR (反應體系20 μL∶2 μL質粒模板，330 mg/L siRNA反義鏈和 U6啟動子引物各0.5 μL，2×反應液10 μL，加水至20 μL；PCR參數：94 ℃ 2 min ；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃20 s，30個循環；72 ℃ 2 min ) 鑒定后并送測序，獲得 4組 pSES-siRARβ質粒。PmeⅠ酶切pSES-siRARβ質粒將其線性化，純化后轉化入攜帶pAd-Easy1骨架質粒的BJ5183感受態細胞內進行同源重組，卡那霉素和鏈霉素篩選，PCR (引物及條件同前) 和以pAd-Easy1為對照的PacⅠ酶切鑒定獲得腺病毒質粒pAd-siRARβ。

表1 大鼠RARβ的siRNA序列Table 1 Sequences of siRNA for rat RARβ

1.2.2 重組腺病毒在 HEK293細胞中包裝并感染大鼠MSCs

將 PacⅠ酶切線性化的重組腺病毒質粒pAd-siRARβ用脂質體轉染 HEK293細胞，每隔3 d在倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白(Red fluorescent protein, RFP) 的表達變化及細胞狀態。繼續培養10~14 d，離心收集漂浮及貼壁細胞，1 mL PBS重懸，-80 ℃/37 ℃反復凍融4次，離心取上清，反復感染HEK293細胞數次獲得高滴度病毒。計算病毒滴度公式：病毒滴度(PFU/mL) =RFP陽性細胞數×病毒液稀釋倍數(PFU) /稀釋后體積 (mL)。MSCs按2×105細胞/孔接種 6孔板中，用 10、20、40、80感染復數(MOI: 病毒顆粒/MSCs) 的腺病毒感染，48 h后在熒光顯微鏡下計數RFP陽性細胞百分率，計算病毒的最佳MOI。

1.2.3 Real-time PCR篩選4組siRNA對ATRA誘導的RARβ表達的抑制效率

MSCs按2×105細胞/孔接種6孔板中，待細胞貼壁后分別用 4組 Ad-siRARβ重組腺病毒感染，同時設置空白對照組及Ad-RFP腺病毒對照組，病毒感染3 d后加入1 μmol/L ATRA處理24 h，提取各組細胞的mRNA，反轉錄成cDNA模板，用能特異擴增大鼠RARβ的引物 (表2) 進行Real-time PCR擴增 (PCR反應體系20 μL：2 μL cDNA模板，330 mg/L引物各 0.5 μL，2×SYBR Green反應液10 μL，加水至20 μL；PCR參數：94 ℃ 3 min ；94 ℃ 10 s，54 ℃ 20 s，72 ℃20 s，40個循環；溶解曲線 65 ℃ ~ 95℃ 每5 s增加0.5 ℃，讀板)，同時以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內參平行管。將篩選出的有效果的 3組Ad-siRARβ腺病毒等摩爾比例混合設為pool組，同上方法檢測對 RARβ的抑制效果。后續實驗siRARβ組均為3種有效Ad-siRARβ腺病毒混合感染細胞。

表2 Real-time PCR引物Table 2 Primers for Real-time PCR

1.2.4 Western blotting及免疫熒光檢測siRARβ pool對ATRA誘導的MSCs的RARβ表達的抑制效果

在 6孔板中設置對照組、ATRA組、Ad-RFP+ATRA組及Ad-siRARβ pool+ATRA組，提取總蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每組蛋白上樣量一致，80 V轉膜1 h至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1~2 h，加入抗RARβ抗體(1∶200) 或β-actin抗體 (1∶200)，4 ℃過夜；洗膜，加入HRP標記的二抗 (1∶2000)，室溫30 min；ECL發光，用Image Pro Plus 6.0軟件分析灰度值。在24孔板中同上設置各組，吸棄培養基，PBS洗滌1次，加500 μL甲醇/孔，-20 ℃固定15 min；5%牛血清白蛋白500 μL/孔，室溫封閉1 h；兔抗大鼠RARβ抗體 (1∶500稀釋于PBS) 4 ℃搖動孵育過夜；Dylight488標記的羊抗兔二抗 (1∶1 000稀釋于PBS) 室溫搖動孵育30 min；PBS 洗滌5 min，重復3次，立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察照相，Image J軟件測定熒光強度值。

1.2.5 Real-time PCR及免疫熒光檢測 siRARβ對ATRA誘導的MSCs神經分化的影響

MSCs按2×105細胞/孔接種6孔板中，待細胞貼壁后用 Ad-siRARβ pool重組腺病毒感染，同時設置MSCs對照組、ATRA處理對照組及Ad-RFP腺病毒對照組，病毒感染3 d后加入1 μmol/L ATRA處理24 h，棄去完全培養基，D-hank’s液洗細胞2次，加入改良神經誘導培養基 (Modified neuronal induction medium，MNM) (含2%二甲亞砜，200 μmol/L丁基羥基茴香醚，20 mmol/L KCl，1.6 mmol/L丙戊酸，8 μmol/L福斯高林，0.8 μmol/L氫化可的松，4 ng/L胰島素的DMEM/F12無血清培養基) 誘導細胞24 h。提取各組細胞的mRNA，反轉錄成cDNA模板，Real-time PCR檢測特異性神經標志物 Nestin、NSE、微管相關蛋白 2 (Microtubule-associated protein 2, MAP-2)、Tau蛋白的表達 (引物見表 2，方法同1.2.3)。在24孔板中同上設置各組，同1.2.4方法檢測神經標志物Nestin、NSE及Tju1的表達。實驗重復3次，每次隨機選取10個非重疊視野，計數陽性細胞占總細胞的百分率。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 pAd-siRARβ腺病毒載體的構建

4組pSES-siRARβ質粒經上述引物PCR可擴出約300 bp的條帶，測序結果與所設計的siRNA序列完全一致。同源重組后的pAd-siRARβ質粒PCR同樣可獲得約300 bp的條帶，PacⅠ酶切質粒可見4 500 bp的特征性小片段和大于30 kb的大片段 (圖1)，表明重組腺病毒質粒pAd-siRARβ構建成功。

2.2 重組腺病毒在 HEK293細胞中包裝并感染大鼠MSCs

pAd-siRARβ質粒經 PacⅠ酶切后轉染HEK293細胞，24 h可觀察到約10%~20%細胞有RFP的表達，10 d可見RFP陽性細胞呈現云霧狀聚集，細胞變圓有病毒空斑形成，待1/2以上細胞脫壁漂浮時收集病毒液，數次感染HEK293細胞，最終得到的4個重組腺病毒滴度在 (4.5×108~7.0×108) PFU/mL范圍。重組腺病毒感染大鼠MSCs的RFP陽性率在60%~70%時，MOI分別為20、20、40、20 (圖2)。

2.3 Real-time PCR篩選siRNA對RARβ表達的抑制效率

ATRA 處理可顯著增強 RARβ的表達16.5±2.34倍(P＜0.05)，4組 Ad-siRARβ處理后ATRA誘導 MSCs的 RARβ表達量分別下降了(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%、(-19.1±1.24)%。將有抑制效果的前3組Ad-siRARβ混合為pool后，對RARβ的抑制效率明顯增強，表達量下降 (78.09±4.24)% (P＜0.01) (圖3)。

圖1 pAd-siRARβ腺病毒載體的構建鑒定Fig. 1 Construction of four pairs of pAd-siRARβ adenovirus recombinant. M1: DNA marker1 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp; M2: λ /Hind III DNA marker 23 130 bp, 9 416 bp, 6 557 bp, 4 361 bp, 2 322 bp, 2 027 bp, 564 bp, 125 bp, 1: pSES-siRARβ 1 U6+site1 anti-sense PCR; 2: pSES-siRARβ 2 U6+site2 anti-sense PCR; 3: pSES-siRARβ 3 U6+site3 anti-sense PCR; 4: pSES-siRARβ 4 U6+site4 anti-sense PCR; 5: pAd-siRARβ 1 U6+site1 anti-sense PCR; 6: pAd-siRARβ 2 U6+site2 anti-sense PCR; 7: pAd-siRARβ 3 U6+site3 anti-sense PCR; 8: pAd-siRARβ 4 U6+site4 anti-sense PCR; 9: pAd-siRARβ 1 PacⅠ; 10: pAd-siRARβ 2 PacⅠ; 11: pAd-siRARβ 3 PacⅠ; 12: pAd-siRARβ 4 PacⅠ; 13: pAd-Easy1 PacⅠ.

圖2 Ad-siRARβ腺病毒在HEK293細胞中包裝及感染大鼠MSCs (以Ad-siRARβ 1為例)Fig. 2 Package of Ad-siRARβ in HEK293 cells and infection of rat MSCs (take Ad-siRARβ 1 as example). (A) pAdsiRARβ 1 transfected HEK293 cells at 1 d. (B) pAd-siRARβ 1 transfected HEK293 cells at 10 d. (C) Ad-siRARβ 1 infected MSCs at 2 d.

圖3 不同處理組RARβ的表達水平Fig. 3 The expression of RARβ in each treated groups. △: P<0.05 compared with control group; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ATRA group; **: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA group.

2.4 siRARβ可抑制 ATRA誘導的 MSCs RARβ表達增高

對照組MSCs中幾乎無RARβ表達，ATRA處理24 h后的MSCs有較強的RARβ蛋白表達，并定位于細胞核 (圖4、5)，Ad-RFP腺病毒感染不影響RARβ的表達及定位變化，Ad-siRARβ組ATRA誘導的RARβ表達明顯降低 (P＜0.05)。

2.5 siRARβ可抑制ATRA誘導的MSCs神經分化

MSCs中僅有少量的Nestin表達，ATRA聯合MNM培養可誘導MSCs向神經分化，分化24 h后表達Nestin、NSE、MAP-2及Tau特異性神經細胞標志 (圖7)，免疫熒光結果顯示Nestin、NSE、Tju1陽性細胞比例為 (50.37±5.01)%、(85.45±6.78)%、(88.02±15.37)% (表3)。siRARβ組相關神經標志物的表達降低，Nestin、NSE、Tju1陽性細胞比例分別為 (38.94±4.26)%、(21.39±5.19)%、(27.79±6.54)%，差異有統計學意義 (P＜0.01)。提示腺病毒介導的siRARβ可顯著抑制ATRA+MNM誘導的MSCs神經分化。

圖4 Western blotting檢測Ad-siRARβ對ATRA誘導的RARβ表達的抑制Fig. 4 Western blotting was performed to detect the inhibition efficiency of Ad-siRARβ to ATRA induced RARβ expression. 1: control group; 2: ATRA group; 3: Ad-RFP+ATRA group; 4: Ad-siRARβ+ATRA group. n=3; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ATRA group.

圖5 免疫熒光檢測各處理組RARβ定位及表達變化Fig. 5 Localization and expression change of RARβ in each group were detected by immunofluorescence (200×). n=5; *: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA group. (A) Immunofluorescence staining. (B) Immunofluorescence intensity.

圖6 不同誘導組神經特異性標志物的的表達水平Fig. 6 Expression of neural specific markers in each induced groups. n=3; *: P<0.05 compared with Ad-RFP+ ATRA+MNM group; **: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA+MNM group.

表3 免疫熒光檢測各神經特異性標志蛋白的陽性細胞比例(±s)Table 3 Positive expression ration of neural specific markers of induced neural cells by immunofluorescence (±s)

表3 免疫熒光檢測各神經特異性標志蛋白的陽性細胞比例(±s)Table 3 Positive expression ration of neural specific markers of induced neural cells by immunofluorescence (±s)

n=10; *: P<0.01 compared with Ad-RFP+ATRA+MNM group.

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3 討論

全反式維甲酸在生物個體發育及維持正常生理狀態中有重要作用，可介導對細胞的分化、增殖、凋亡和免疫調節等多種生物學功能[6]。ATRA也是誘導神經板生成的重要生物活性物質，能促進多潛能神經嵴前體細胞的生存、增殖及誘導其向神經元分化[7]。骨髓間充質干細胞是一類具有自我更新及跨胚層分化能力的成體干細胞，在特定誘導環境下可分化為神經樣細胞，移植動物可在中樞神經系統存活并分化為有一定功能的神經樣細胞[8]。本課題組前期研究發現：ATRA預誘導可顯著提高MSCs向神經樣細胞的轉化及存活率[4]，并有效改善MSCs對新生大鼠缺氧缺血性腦病的移植治療效果[9]。

ATRA主要通過維甲酸受體RAR (包括α、β、γ 3個亞型) 介導信號轉導，影響下游基因的轉錄調控[10]，其信號調控的多樣性取決于組織細胞類型、背景及維甲酸信號通路相關因子的表達狀態。ATRA可通過調控RAR亞型的表達，導致神經管的發育缺陷，提示RAR的表達模式與神經管的發育密切相關，其中RARβ表達的上調是實現神經管后孔關閉的必要因素[11]。Goncalves MB等[12-13]發現RARα激活狀態下，神經祖細胞主要分化為星形膠質細胞和少突神經膠質細胞，而RARβ激動主要誘導神經元的形成，并上調神經發育重要轉錄因子islet-1/2的表達，提示RARα調節神經膠質細胞的分化，而RARβ決定神經元表型。我們前期檢測到大鼠原代MSCs中RARα、RARγ有低水平的表達，而 RARβ幾乎不表達，MSCs神經誘導過程中各RARs表達均有不同程度上調，細胞向神經元及神經膠質細胞方向分化。而ATRA預誘導促進MSCs向神經元轉化，抑制膠質細胞分化，經不同濃度 (0.01、0.1、1 μmol/L) ATRA處理24 h后RARα、RARγ表達沒有變化，而RARβ表達顯著增高，且具有明顯的量效關系[3]。因此我們認為ATRA可能通過上調RARβ激活維甲酸信號途徑，促進MSCs向神經方向分化及神經元表型的決定。

為了證實這一假設，我們擬采用siRNA抑制ATRA處理后MSCs中RARβ的表達，以便進一步研究RARβ對維甲酸信號轉導途徑促MSCs成神經分化的影響及具體的分子機制。腺病毒介導siRNA表達是目前基因工程領域常用的技術手段[14]， 在本實驗中，我們選擇帶有U6和H1雙啟動子的siRNA構建系統[15]，構建了4組攜帶針對大鼠RARβ的siRNA腺病毒，感染MSCs能達到60%以上的高效率，并從中篩選出3組能有效抑制RARβ內源性表達的siRNA。由于siRNA具有序列相似性，可能抑制其他具有相似位點的基因表達，為了盡可能地減少這種脫靶(off-target) 效應[16]，我們采用混合池 (pooling)的策略，即用等比例的不同位點siRNA混合。因為3組siRNA均是針對RARβ這一靶基因，但是off-target的非特異性位點卻不一樣，從而減小了off-target幾率，而混合后siRNA的knockdown效率卻等同于、甚至超過單獨siRNA效率的加和[17]。我們的結果也顯示，pool組的抑制效率明顯高于各個單獨siRNA組。

隨后，我們檢測了siRARβ對MSCs神經分化的影響。MSCs僅表達少量神經干細胞標志Nestin，ATRA預誘導聯合MNM神經誘導是本實驗室誘導MSCs體外神經分化的成熟模型[18]，誘導后細胞折光性增強，并逐漸伸出突起，呈雙極或多極神經元細胞形態，神經元早期及特異性標志蛋白 NSE、Tju1[19]，神經元樹突標志物MAP-2，神經元軸突標志物Tau蛋白[20]的表達顯著增高。siRARβ抑制RARβ的表達，從一定程度上阻斷了ATRA與RARβ結合后導致的維甲酸信號轉導途徑的級聯放大反應，減少了與目的基因啟動子區域的特異性 RAR順式作用元件(RARE) 結合，抑制神經發育相關基因的轉錄。然而，我們發現siRARβ組ATRA聯合MNM誘導的神經蛋白的表達水平，低于MNM單獨誘導，可能的原因在于腺病毒介導的siRARβ，不僅抑制了ATRA誘導的RARβ表達增高，在MSCs整個體外誘導過程中，包括 MNM神經誘導階段，siRNA的knock-down效應仍然有影響。因此，在后續的研究中，可能需要采用RARβ的特異性抑制劑LE135[21]，階段性地抑制RARβ活性。

本實驗成功構建并篩選出了針對大鼠 RARβ的siRNA腺病毒，并在大鼠MSCs中證實其能有效抑制ATRA誘導的RARβ內源性表達增高，同時抑制MSCs的體外神經分化。為深入研究RARβ對維甲酸信號轉導途徑在MSCs成神經分化中的作用及具體分子機制提供了重要的實驗基礎。

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