針對Oct-4和Survivin基因的雙靶向shRNA腺病毒載體的構建及其對肝癌細胞的抑制作用

王端明，王敬晗，李林芳，陳靜波，蘇長青

1 石河子大學醫學院 新疆地方與民族高發病實驗室，新疆 石河子 832000

2 第二軍醫大學東方肝膽外科醫院 分子腫瘤研究室，上海 200438

3 新疆畜牧科學院，新疆 烏魯木齊 830000

原發性肝癌是最常見的致死性惡性腫瘤，預后差，多數患者在首次手術后一年內復發或轉移，一年生存率極低[1]。而我國又是乙型肝炎感染人群最多的國家，肝癌的發病率明顯較其他國家偏高[2-3]。因此，深入了解肝癌發病的分子機制并積極探索新的治療手段是提高肝癌整體治療效果的關鍵。腫瘤細胞具有較強的凋亡抗性，并在一定程度上具有干細胞特性，是腫瘤復發、轉移的重要原因之一。Survivin是近年來克隆出的凋亡抑制蛋白家族 (IAPs) 新成員之一，也是迄今為止發現的抑制凋亡作用最強的凋亡抑制因子[4]。正常情況下僅表達于胚胎組織，在胚胎發育和細胞分化中起著調控細胞有絲分裂、抑制細胞凋亡的重要作用[5]。目前研究發現 Survivin在絕大多數腫瘤組織中高表達，提示Survivin與腫瘤的發生發展存在極為密切的關系[6-7]。Survivin抑制腫瘤細胞凋亡的分子機制還有許多尚待解決的疑難問題[8-9]。其中，Survivin與其他調控因子的相互作用尤為值得注意。Oct-4屬于POU轉錄因子家族，是一類DNA結合蛋白，能夠激活在啟動子或增強子區域內帶有順式作用元件的基因轉錄，對維持和調節干細胞狀態起著關鍵作用。已有研究表明，很多類型的腫瘤細胞也有高水平的Oct-4表達，可能是參與了腫瘤細胞的自我更新[10]。鑒于此，本研究將應用分子克隆和同源重組技術構建特異性針對 Oct-4和Survivin基因的雙靶向shRNA腺病毒載體，并觀察其對腫瘤細胞增殖的抑制作用，通過裸鼠荷瘤實驗檢驗其抗腫瘤能力，旨在優化腫瘤基因治療的方法，尋求更為有效的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

胎牛血清購自PAA公司，DMEM粉劑購自Gibco公司，各種限制性內切酶均購自 NEB公司，質粒提取試劑盒、病毒基因組提取試劑盒QIAGEN DNA Blood Mini Kit購自QIAGEN公司，膠回收試劑盒購自MN公司，鼠抗人Oct-4單抗購自美國Santa Cruz公司，兔抗人Survivin多抗購自美國R&D生物公司，山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG、雙染SP試劑盒購自福州邁心生物技術公司，細胞裂解蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自 Pierce公司，預染蛋白 Marker購自 Fermentas公司，轉染試劑LipoFectamine2000試劑盒購自Invitrogen公司，其余試劑均為國產或進口分析純。

1.1.2 菌株、質粒和細胞株

大腸桿菌菌株 DH5α、重組腺病毒質粒pAd-EGFP、肝癌細胞系EHBH-H1由第二軍醫大學東方肝膽外科醫院實驗室保存，腺病毒包裝用HEK293細胞株購自美國ATCC。

1.1.3 實驗動物

清潔級BALB/c裸鼠30只，4周齡，體重16~18 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，合格證號SCXK (滬) 2009-0003。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

人肝癌細胞系EHBH-H1用含10%胎牛血清、100 IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液，置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養箱內培養，待生長細胞達到80%以上的匯合度時進行傳代培養。

1.2.2 Oct-4和Survivin基因shRNA的設計與合成

根據 GenBank 的 Survivin 基因序列(Accession No. NM001168) 和 Oct-4基因序列(Accession No. DQ486513.1) 設計相應的shRNA。設計條件為：1) 排除含有連續4個G/C或A/T的序列；2) 排除兩端存在AA的序列；3) 排除定位在堿基易突變點的序列；4) 排除其他人類基因的同源性序列。Surv-shRNA序列為 5′-gaa agt gcg ccg tgc cat c-3′，位于全長Survivin編碼序列的第387~405 bp。Oct4-shRNA序列為5′-ccc tca ctt cac tgc act gta-3′，位于全長Oct-4編碼序列的第 1233~1253 bp。同時設計陰性對照 (CtrlshRNA) 序列5′-gac ttc ata agg cgc atg c-3′。由武漢市晶賽生物工程技術有限公司合成，合成的編碼shRNA的DNA結構為：XhoⅠ+BamHⅠ+U6+ Sense DNA+Loop (ttc aag acg) +Antisense DNA+ TTTTTT+BglⅡ，克隆入pGenesil-1.1。

1.2.3 腺病毒載體的構建與病毒包裝

將上述構建的Survivin、Oct-4和陰性對照3個shRNA質粒酶切回收，目的基因片段插入到腺病毒穿梭載體pDC312的多克隆位點，經酶切鑒定正確后，分別命名為pDC312-Surv-shRNA、pDC312-Oct4-shRNA和pDC312-Ctrl-shRNA。同時將 Surv-shRNA (正向插入 SalⅠ+BglⅡ) 和 Oct4-shRNA (反向插入BamHⅠ+BglⅡ) 克隆入pDC312中，構建含雙靶向 shRNA 的載體pDC312-Dual-shRNA。

用含有 10%胎牛血清的 DMEM培養HEK293細胞，對數生長期時用0.25%胰酶消化傳代，轉種于6孔培養板，置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養箱內生長48 h，待細胞匯合度為60%時，同時轉染pBHGloxdeltaE13Cre和上述含 shRNA的腺病毒穿梭載體質粒 pDC312-Dual-shRN、pDC312-Surv-shRNA、pDC312-Oct4-shRNA和 pDC312-Ctrl-shRNA，轉染方法參考Invitrogen公司 LipoFectamine2000試劑盒說明書。共轉染12 d后出現病毒空斑，經過空斑純化，得到重組腺病毒，分別命名為Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA和Ad5-CtrlshRNA。用病毒基因組提取試劑盒QIAGEN DNA Blood Mini Kit提取病毒基因組DNA，進行PCR鑒定。鑒定正確后，采用 HEK293細胞內擴增及常規氯化銫梯度離心純化方法，擴增及純化腺病毒。

1.2.4 shRNA 腺病毒載體對基因表達的沉默作用

取對數生長期的肝癌細胞系EHBH-H1鋪于6孔板，24 h后按 MOI=50分別感染腺病毒Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA和 Ad5-Ctrl-shRNA，并設不加病毒的對照組，在37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養箱內培養48 h后移去培養液，PBS洗3次后，加細胞裂解蛋白提取液，室溫下處理30 min，12 000 r/min離心收集上清，定量后分裝于 EP管-80 ℃保存。

Western blotting操作方法檢測培養細胞中Oct-4與Survivin蛋白的表達情況。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，每孔上樣20 μL，電泳結束后用半干轉印儀將電泳產物轉移到NC膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗 (1∶1 000稀釋)，室溫孵育3~4 h或4 ℃過夜，TBST洗膜5 min，重復5次，加辣根過氧化物酶標記的二抗 (1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min，重復5次后進行化學發光反應，暗室曝光，膠片掃描后分析目標條帶的分子量和光密度值。

1.2.5 MTT實驗

收集對數生長期的EHBH-H1細胞計數，用10%胎牛血清DMEM培養液制成單細胞懸液，按1×l04個細胞/孔鋪96孔板，每孔100 μL。置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養箱中培養過夜。用無血清培養液稀釋病毒，按MOI = 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50加入l00 μL稀釋好的病毒液分別感染腺病毒，對應于每個MOI值設置4個復孔，置于37 ℃飽和濕度及5% CO2的培養箱中，7 d后棄去培養液，加入無血清的DMEM培養液100 μL/孔和5 g/L的MTT 1 0 μL/孔，繼續培養4~6 h，之后每孔加入100 μL 10% SDS培養過夜，用酶聯免疫檢測儀570 nm波長測定光吸收值，計算細胞存活率。

1.2.6 動物實驗

取對數生長期的EHBH-H1細胞懸液，計數后按5×106個細胞/100 μL注射于裸鼠前肢右側皮下，恒溫、通風、無菌條件下飼養。注射約1周后，在接種區皮下出現米粒大小移植瘤。剔除瘤體過大和過小的裸鼠，剩余25只，隨機分為5組：Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA、Ad5-Ctrl-shRNA、空白對照組，每組5只。每組釋以2×108PFU/100 μL的重組病毒瘤內多點注射，隔日1次，共5次；空白對照組以生理鹽水替代重組病毒注射，100 μL×5次。開始治療后，定時測量瘤體大小，以“最大徑×最小徑2×0.5”公式計算瘤體體積。

觀察周期結束，斷頸處死小鼠，取瘤體標本，以10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋切片。采用 SP雙染色法免疫組化定位腫瘤組織中Survivin、Oct-4的表達。在5個高倍視野下計數每張切片中陽性細胞的比例。

1.3 統計學處理

2 結果與分析

2.1 腺病毒介導特異性shRNA對基因表達的沉默作用

EHBH-H1細胞系按MOI=50感染特異性腺病毒載體48 h后，Ad5-Dual-shRNA組Oct-4與Survivin蛋白的表達均轉陰，Ad5-Surv-shRNA和Ad5-Oct4-shRNA能夠各自下調相應的基因表達水平，但Ad5-Oct4-shRNA對Survivin蛋白的表達也有一定的下調作用 (圖1)。結果顯示雙靶向載體Ad5-Dual-shRNA能夠有效地沉默Oct-4與Survivin基因的表達。

2.2 雙靶向shRNA腺病毒對肝癌細胞增殖的抑制作用

EHBH-H1細胞按不同的感染強度感染shRNA腺病毒，隨著病毒滴度的增加，細胞的存活率都有明顯的下降 (圖 2)。在 MOI=0.1和 1時，Ad5-Dual-shRNA組細胞的平均存活率已下降到 43.7%和 22.4%，顯著低于其他各組(P<0.01)。Ad5-Surv-shRNA 組與 Ad5-Oct4-shRNA 組的細胞存活率也低于空白對照和Ad5-Ctrl-shRNA組。結果說明特異性雙靶向載體Ad5-Dual-shRNA 能夠顯著地抑制肝癌細胞系EHBH-H1的增殖。

2.3 雙靶向shRNA腺病毒抑制肝癌裸鼠移植瘤的生長

EHBH-H1細胞裸鼠移植瘤經病毒治療后，第10天Ad5-Dual-shRNA組瘤體體積已出現明顯差異 (圖 3)。至 20 d，Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA、Ad5-CtrlshRNA、空白對照組腫瘤體積分別為 (250.87± 17.37)、(671.27±212.03)、(566.16±123.71)、(980.66±95.84)、(1 101.13±273.14) mm3。統計發現，Ad5-Dual-shRNA、Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA 組與對照組相比差異顯著(P＜0.01)，以 Ad5-Dual-shRNA組療效最好。Ad5-Ctrl-shRNA 組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

圖1 Survivin和Oct-4特異性shRNA對目的基因表達的沉默作用Fig. 1 The silencing effect of specific shRNA on the expression of Survivin and Oct-4 proteins. 1: control group; 2: Ad5-Dual-shRNA group; 3: Ad5-Surv- shRNA group; 4: Ad5-Oct4-shRNA group; 5: Ad5-Ctrl-shRNA group.

圖2 MTT法檢測癌細胞存活率Fig. 2 Cell viability was assayed by MTT test.

圖3 肝癌裸鼠移植瘤shRNA病毒治療的療效對比Fig. 3 HCC xenograft models were established by subcutaneous injection of 5×106 EHBH-H1 cells per mouse in five groups of nude mice (n=5/group).

2.4 病理檢查

移植瘤治療后，取瘤體標本，石蠟包埋切片，做 Oct-4和 Survivin表達的雙染免疫組化，Survivin標記為深藍色 (NBT/BCIP顯色)，Oct-4標記為紅色 (AEC顯色)?？梢钥闯觯瞻讓φ战M Oct-4與 Survivin的表達呈雙陽性；Ad5-Surv-hRNA組Survivin陰性而Oct-4陽性，陽性反應主要集中在細胞核和細胞漿；Ad5-Oct4-shRNA組Oct-4陰性，同時 Survivin陽性表達率下降；Ad5-DualhRNA組 Oct-4和 Survivin表達均明顯下降(圖4)。

圖4 肝癌裸鼠移植瘤免疫組化檢測Survivin (NBT/BCIP藍色標記) 和Oct-4 (AEC紅色標記) 的表達Fig. 4 The results of immunocytochemistry for Survivin (prussian blue stained with NBT/BCIP) and Oct-4 (red stained with AEC).

3 討論

Survivin基因已成為腫瘤藥物和基因治療的一個理想靶點，其抑制腫瘤細胞凋亡的作用已有較多文獻報道，主要是通過抑制caspase級聯反應下游的 caspase-3、caspase-7等發揮其抗凋亡作用[11]，而其體內調節機制以及與其他關鍵基因之間的相互作用還存在諸多問題有待解決。有實驗證實，小鼠胚胎細胞 Survivin的功能活性受Oct-4轉錄因子的調節，降低細胞Oct-4表達會明顯抑制Survivin基因啟動子的活性，從而抑制Survivin的表達[12]。近來的研究也證實，人體很多類型的腫瘤細胞都有較高水平的Oct-4表達，可能參與維持腫瘤細胞特別是腫瘤干細胞的自我更新、阻止腫瘤細胞分化等功能[13]。那么，在惡性轉化的腫瘤細胞中，Survivin和Oct-4之間是否存在相互調節或影響的關系，目前國內外尚未見文獻報道。我們已有的研究發現，在肝膽腫瘤中轉錄因子Oct-4對Survivin的表達有正向調節作用，Oct-4是Survivin表達的上游調控基因。Oct-4引起的Survivin增強表達，直接促進了腫瘤細胞周期的進展和細胞凋亡的抑制，而沉默Survivin表達則引起細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡[14]。

RNA干擾 (RNA interference, RNAi) 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。其作用機制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產生干擾小RNA (siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補結合，特異性酶降解靶 RNA，從而抑制、下調基因表達。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已經發展成為基因治療、基因結構功能研究的快速而有效的方法[15]。針對腫瘤細胞Survivin高表達而設計的siRNA在腦膠質瘤[16]、胰腺癌[17]、膀胱癌[18]的實驗中，均能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長，產生抗癌作用。結果顯示RNAi技術用于腫瘤的基因治療具有可靠的療效和良好的發展前景。

根據上述Oct-4增強Survivin表達的調節機制，本項研究構建 Oct-4和 Survivin雙特異性shRNA的腺病毒表達載體，研究其對肝癌細胞EHBH-H1的抑制作用。體外細胞學研究發現，雙靶向 shRNA載體能夠同時有效地沉默 Oct-4與 Survivin基因的表達，從而抑制肝癌細胞系EHBH-H1的增殖活性，其效果與病毒感染強度密切相關。雙靶向shRNA載體對肝癌細胞生長的抑制作用，明顯強于單一靶向的shRNA載體。研究中發現，Oct4-shRNA可引起Survivin表達抑制，這與我們先前的實驗相一致，證實 Oct-4是Survivin的上游調控因子[14]。在EHBH-H1裸鼠移植瘤的實驗中，我們進一步證實了針對Oct-4和Survivin的雙特異性shRNA載體能夠沉默Oct-4與Survivin的表達，明顯抑制移植瘤的生長。而單一抑制Survivin的表達，對移植瘤的抑制效果和維持時間均十分有限，停止治療后移植瘤出現恢復性生長的現象。單一抑制Oct-4的表達，療效好于Survivin特異性shRNA載體。

綜上所述，我們構建的針對Oct-4和Survivin的雙靶向特異性腺病毒載體，不僅能夠有效抑制目的基因的表達，而且能在體內、體外抑制肝癌細胞的增殖活性和裸鼠移植瘤的生長，發揮出良好的抗腫瘤效果。實驗證明，雙靶向 shRNA表達載體在腫瘤基因治療中具有更好的優勢。而且，在抑制癌細胞Survivin表達控制細胞生長的同時，敲除Oct-4的表達有可能進一步抑制具有腫瘤干細胞特性的細胞的增殖。

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