電穿孔介導小干擾RNA高效轉染小鼠附植前胚胎

常博皞，彭輝，田進海，蘇建民，張亨德，白學堯，張涌

西北農林科技大學動物醫學院 農業部生物技術重點實驗室，陜西 楊凌 712100

近些年由siRNA (Small interfering RNA) 介導的RNA干擾 (RNAi) 已經逐漸成為研究基因功能的有力工具[1-2]。將制備好的siRNA導入細胞中的方法主要有顯微注射法、脂質體轉染法、電穿孔法等。相比而言，電穿孔法具有操作簡便、轉染效率高等優點[3-5]。電穿孔的原理是細胞在脈沖電場作用下，細胞膜脂雙層上形成瞬時微孔，導致其通透性和膜電導瞬時增大，使得在正常生理情況下細胞膜難以通透的物質能夠進入細胞[6-7]。電穿孔法已經成功應用于向體外培養的細胞[8-9]、活體組織[10]、附植后胚胎[11]和雄性配子[12]導入蛋白質、糖類和DNA等。但是對由透明帶包裹的附植前胚胎采用電穿孔方法進行轉染具有特殊的難度。本研究通過對透明帶弱化、優化電壓、脈沖時間和脈沖次數等不同電穿孔參數，并結合使用不同介質作為電轉緩沖液，采用統計學方法和形態學觀察比較了各實驗組別轉染效果，建立了siRNA轉染小鼠附植前胚胎的電穿孔方法，為采用由 siRNA介導的 RNAi技術研究基因在小鼠附植前胚胎中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

孕馬血清促性腺激素 (Pregnant mare serumgonadotrophin，PMSG) 和人絨毛膜促性腺激素 (Human chorionic gonadotropin，hCG) 購自寧波第二激素廠；Cy3標記的陰性對照 siRNA (#AM4621) 和 siPORT (#AM4502) 購自美國Ambion公司；臺氏液 (#T1788) 購自美國Sigma公司。電穿孔儀器 (ECM 2001 Electro Cell Manipulator) 購自美國BTX公司；電轉槽為電穿孔儀器所配套提供，電極間距為1 mm；opti-MEM購自美國Invitrogen公司；其他試劑如未經特殊說明均購自美國Sigma公司。

1.2 試驗動物與胚胎采集

健康成年雄鼠及5~7周齡，體重20~25 g昆明小白鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心。人工控制飼養溫度20 ℃~24 ℃，相對濕度50%~60%，人工照明12 h光照，12 h黑暗。取雌性小鼠，腹腔注射PMSG 10 IU/只，46 h后注射hCG 10 IU/只，與公鼠1∶1合籠過夜。16 h后檢查陰道栓，查見陰道栓的雌鼠為受精鼠。對受精鼠逐一頸椎脫臼法處死后，無菌條件下取出雙側輸卵管，戳破膨大壺腹部，游離出由顆粒細胞包裹的受精卵細胞團。將細胞團置于盛有 PBS (Phosphate buffered saline) 的35 mm皿中清洗1次，隨后將細胞團轉移至 0.2%透明質酸酶中消化，顯微鏡下觀察消化到適當程度，用吸卵針將受精卵吸入Hepes-KSOM (H-KSOM) 中終止消化，輕輕吹打至胚胎完全脫去顆粒細胞，得到所需裸卵，H-KSOM中清洗3次，移入至少提前0.5 h平衡的KSOM[13]培養液中，放入37 ℃、5% CO2培養箱內體外培養得到各時期附植前胚胎。

1.3 電穿孔轉染小鼠附植前胚胎

使用Cy3標記的陰性對照siRNA (10 μmol/L)電穿孔轉染小鼠受精卵，此siRNA序列為19 bp隨機序列，與已知的小鼠、大鼠和人的基因無同源性，因此導入胚胎后對胚胎基因表達不會產生影響。通過熒光倒置顯微鏡觀察分析轉染效果，確定最佳實驗條件和電穿孔參數。采用最佳實驗條件和電穿孔參數轉染2-cell胚胎、4-cell胚胎、8-cell胚胎、桑椹胚和囊胚，觀察轉染效果。將采集的受精卵在PBS中清洗2次后移入臺氏液中靜置不同時間，用以不同程度地消化透明帶，計時結束后立即加入1 mL H-KSOM終止消化，然后吸出胚胎在PBS中清洗3次，最后用吸卵針將受精卵轉移至盛有opti-MEM的35 mm皿中清洗2遍后備用。按照 siPORT試劑說明書配置電穿孔溶液。50 μL opti-MEM加3 μL siPORT，室溫避光靜置10 min，siPORT的作用是可以與siRNA形成復合物，促進siRNA在電轉染過程中更高效地進入細胞。50 μL opti-MEM加 10 μL Cy3標記的陰性對照siRNA。將稀釋的siPORT和稀釋的Cy3標記的陰性對照siRNA按1∶1混合，輕輕抽吸混勻，室溫避光靜置10 min。將胚胎轉移至配置好的電穿孔溶液中，注意轉移胚胎時要求盡可能少吸液體，以避免稀釋電穿孔溶液。用吸卵針將含有胚胎的電穿孔溶液滴加至電轉槽正負電極縫隙間，均勻分散胚胎。選擇不同電壓，脈沖時間和脈沖次數進行電穿孔轉染。完成轉染后吸出胚胎置于H-KSOM中清洗，熒光倒置顯微鏡下觀察，統計分析轉染效果。

1.4 實驗分組

使用臺氏液對胚胎透明帶進行消化，消化時間設計為未進行電轉的胚胎對照組，未經消化對照組，消化10、20、30 s，電穿孔參數設定為10 V，1 ms，3次；電壓設計為10、20、30、40、50 V，臺氏液消化10 s，脈沖時間1 ms，3次；脈沖時間設計為600 μs、800 μs、1 ms、2 ms、3 ms，臺氏液消化10 s，電壓30 V，3次；脈沖次數設計為1、2、3、4次，脈沖間隔為儀器默認間隔1 s。臺氏液消化10 s，電壓30 V，1 ms；以KSOM、PBS和opti-MEM分別作為電轉緩沖液，電穿孔參數設定為30 V，1 ms，3次。

1.5 轉染胚胎觀察

電穿孔后將胚胎用H-KSOM清洗后熒光顯微鏡下檢測存活率、轉染率和陽性存活胚胎囊胚率。先在明場下統計胚胎數目，固定視野轉換熒光光源，統計發出紅色熒光的胚胎數，在曝光時間為1 s時明顯觀察到紅色熒光的存活胚胎計為陽性轉染胚胎。

1.6 統計學方法

2 結果與分析

2.1 原核胚透明帶消化時間對電穿孔效率的影響

未進行消化處理的原核胚電穿孔后胚胎存活率較高，與消化 20 s實驗組相比差異顯著(P＜0.05)，暗示對透明帶的消化處理在一定程度上可能會對胚胎的發育帶來不利影響。但與消化10 s實驗組差異不顯著，這說明只要在適度的消化時間內，透明帶弱化處理的過程對胚胎的影響是微弱的，不顯著的；使用臺氏液消化30 s后，透明帶變得很薄甚至完全被消化，電穿孔后熒光顯微鏡觀察顯示存活胚胎Cy3熒光陽性率，即轉染率 (85%) 顯著高于未消化組和消化 10 s組，與消化20 s實驗組差異不顯著；胚胎消化30 s后胚胎存活率 (31%) 顯著低于其他3組(P＜0.05)；消化10 s和20 s實驗組轉染率無顯著差異，但兩組均顯著高于未處理組 (P＜0.05)；消化 10 s實驗組陽性存活胚胎囊胚發育率顯著高于消化20 s和30 s實驗組。另外未經消化處理和電穿孔過程的胚胎在體外培養的囊胚率達到92%，顯著高于其他各組，包括未經消化處理而只進行電穿孔的實驗組，這說明電穿孔過程中可能由于胚胎所處位置導致其所受場強不均等原因而不可避免地對少部分胚胎帶來不可恢復的損傷 (表1)。

圖1為不同實驗組胚胎電穿孔后的顯微照片。A、D、G、J分別為明場下胚胎顯微照片，B、E、H、K分別為同一胚胎的紅色熒光照片，C、F、I、L為明場與熒光的合成照片。

2.2 電壓對電穿孔效率的影響

轉染率在30 V時達到最高 (95%)，與電壓10 V和20 V實驗組差異顯著 (P＜0.05)，繼續增加電壓轉染率變化不大，但胚胎存活率和存活胚胎囊胚發育率急劇下降。電壓為 10、20、30 V 實驗組間存活胚胎囊胚發育率差異不顯著 (表2)。

表1 透明帶消化時間對電穿孔效率的影響Table 1 Electroporation efficiency after different duration of digestion

圖1 不同消化時間的胚胎電穿孔后的紅色熒光水平Fig.1 Cy3 Fluorescence level in embryos when they were electroprated after different duration of digestion. Bar=40 μm. (A?C) Zona intact embryo. Fluorescence is present in the zona pellucida but not in the cytoplasm of the cell. (D?F) Duration of digestion was 10 s. (G?I) Duration of digestion was 20 s. (J?L) Duration of digestion was 30 s.

表2 電壓對電穿孔效率的影響Table 2 Electroporation efficiency at different voltages

2.3 脈沖時間對電穿孔效率的影響

胚胎存活率隨脈沖時間的延長而降低，脈沖時間為600 μs、800 μs和1 ms時差異不顯著，繼續延長脈沖時間，存活率顯著下降 (P＜0.05)；轉染率隨脈沖時間的延長而提高，600 μs、800 μs和1 ms三個實驗組轉染率提高程度差異顯著，1 ms時轉染率最高達到93%，繼續增加脈沖時間轉染率無顯著提高，但存活胚胎囊胚發育率在2 ms和3 ms實驗組中顯著降低 (P＜0.05) (表3)。

2.4 脈沖次數對電穿孔效率的影響

胚胎存活率隨著脈沖次數的增加而降低，但脈沖次數為1、2、3次時差異不顯著，脈沖次數為4次時，相比前3組胚胎存活率降低顯著(P＜0.05)；轉染率隨著脈沖次數的增加而顯著提高 (P＜0.05)，脈沖次數增加到4次以后，轉染率提高不顯著；陽性轉染胚胎囊胚發育率隨脈沖次數的增加而降低，但相鄰兩實驗組間囊胚率降低不顯著 (表4)。

2.5 電轉緩沖液對電穿孔效率的影響

使用KSOM、PBS和opti-MEM分別作為電轉緩沖液時，電穿孔后的胚胎存活率 3組間無顯著差異；使用opti-MEM作為電穿孔緩沖液時Cy3陽性轉染率最高，達到92%，使用 KOSM實驗組轉染率最低，3組間差異顯著 (P＜0.05)；使用 PBS作為電轉緩沖液時的陽性轉染存活胚胎的囊胚發育率顯著低于其他兩組。

2.6 電穿孔轉染其他時期胚胎

通過上述實驗確定電穿孔轉染小鼠受精卵條件為：臺氏液消化10 s，電穿孔參數為電壓30 V，脈沖時間1 ms，脈沖次數3次。使用此方法轉染小鼠其他時期胚胎，包括2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚。圖2為轉染后培養4 h熒光顯微鏡下觀察拍照照片。

表3 脈沖時間對電穿孔效率的影響Table 3 Electroporation efficiency of different pulse duration

表4 脈沖次數對電穿孔效率的影響Table 4 Electroporation efficiency of different number of pulse

表5 電轉緩沖液對電穿孔效率的影響Table 5 Electroporation efficiency of different electroporation buffers

圖2 電穿孔轉染小鼠附植前各時期胚胎Fig. 2 Electroporation of mouse embryos in various stages with Cy3-labeled negative control siRNA. Bar=40 μm. (A?C) Embryos electroporated at 2-cell stage. (D?F) Embryos electroporated at 4-cell stage. (G?I) Embryos electroporated at 8-cell stage. (J?L) Embryos electroporated at morula stage. (M?O) Embryos electroporated at blastocyst stage.

3 討論

透明帶對于胚胎在體內的正常發育是非常重要的[14-15]，然而將透明帶完整的胚胎，即實驗設計中未處理的實驗組胚胎直接用于電穿孔時轉染效率很低，并且通過熒光顯微鏡觀察發現電穿孔后的胚胎在透明帶上有異常熒光亮點(圖1)，熒光直接反映的是所標記的siRNA的位置，因此異常的熒光亮點說明siRNA很少能穿透透明帶進入胚胎細胞內部，而是在透明帶上形成聚集，造成假陽性轉染。

盡管去除透明帶，即消化30 s后的小鼠原核胚在體外培養中也能成功發育到囊胚，但是發育率顯著低于透明帶完整的胚胎 (表1)。并且去除透明帶的胚胎容易黏附于吸卵針管壁內，在清洗和轉移過程中極易受到損傷，這也在一定程度上降低了胚胎利用率，增加了實驗成本，因此盡管存活胚胎的Cy3陽性率即轉染率較高 (表1)，但我們依然放棄完全去除透明帶的方案。我們采用一方面對透明帶進行適度弱化，另一方面提高電穿孔時的電壓，優化脈沖時間和脈沖次數。Grabarek等[16]在使用電穿孔方法向胚胎導入dsRNA (double-stranded RNA ) 時采用10 V電壓，然而通過表2可以看出30 V電壓的胚胎存活率相比10 V有所降低，但是犧牲的存活率獲得的是顯著提高的陽性轉染率，這使得采用此方法進行 RNA干擾的實驗結果的可信度大為增強。電壓再高，則轉染后的胚胎存活率會顯著降低[17]，這一點從表2中也可以看出。

脈沖時間對轉染效率也有較大影響，脈沖時間的延長可以提高陽性轉染率，但是脈沖時間過長會導致胚胎局部過熱從而對胚胎造成不可恢復的損傷，同時在瞬時微孔的持續期間所引起的胚胎與電轉緩沖液之間的物質交換，也可能造成胚胎內部穩態的破壞，從而導致胚胎存活率下降[18]。脈沖時間太短則不能使足夠的 siRNA進入胚胎內部[19]。通過實驗可以看出，脈沖時間從600 μs延長至1 ms時，陽性轉染率逐漸增加。繼續延長脈沖時間，轉染率提高不顯著，但是胚胎存活率開始顯著下降 (表3)。

實驗證明大多數細胞在脈沖次數為2~4次的條件下可以取得較為理想的轉染效果。脈沖次數的增加一方面增加穿孔數量，另一方面脈沖次數的增加也提高了脈沖觸發電滲透、內吞等運輸方式的概率[20]。實驗數據表明 (表4)，對于弱化了透明帶的胚胎，在綜合考慮轉染效率、胚胎存活率和囊胚發育率的情況下，3次脈沖可以獲得較好的轉染效果。

我們也測試了幾種候選的電轉緩沖液。使用KSOM 培養液直接作為電轉緩沖液用于電穿孔時，在兩電極間產生大量絮狀沉淀，這在很大程度上降低了胚胎對siRNA的攝入；使用PBS作為電轉緩沖液時有少量沉淀，且存活胚胎的囊胚發育率極低，原因可能是胚胎受電擊后產生的瞬時微孔使緩沖液組分能直接進入胚胎內，因此使用與細胞質組分差異較大的緩沖液會造成胚胎發育率降低；使用opti-MEM作為電轉緩沖液時未觀察到明顯沉淀物生成，且電轉后胚胎發育形態良好。

由此我們確定了通過電穿孔方法向小鼠受精卵導入siRNA的技術路線，即首先使用臺氏液對胚胎透明帶進行弱化處理，消化時間為10 s。進而對透明帶弱化后的胚胎進行電轉染，電轉緩沖液使用opti-MEM并結合siPORT轉染試劑，電穿孔參數設定為電壓30 V，脈沖時間1 ms，脈沖次數3次。使用此方法又轉染了小鼠附植前其他時期胚胎，包括2-cell、4-cell、8-cell、桑椹胚和囊胚，均取得良好效果，胚胎發育形態也未觀察到任何異常?？傊?，本研究建立并優化了一種 siRNA簡便、高效轉染小鼠附植前胚胎的方法，為采用由siRNA介導的RNAi技術研究基因在小鼠附植前胚胎中的功能提供了技術參考。

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