基于代謝流量分布信息理解大腸桿菌中異檸檬酸裂解酶調節因子的代謝調控作用

柳志杰，周利，花強

華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237

基因的表達是通過不同的轉錄調節因子來調控的，轉錄調節因子是一類能結合在DNA特定序列上的蛋白。轉錄調節因子結合在DNA特定序列上就能促進或者抑制RNA聚合酶 (RNAP)的結合能力。RNA聚合酶 (RNAP) 親和力的降低一般會降低基因的表達，而RNAP親和力的提高一般會加強基因的表達。大腸桿菌中的異檸檬酸裂解酶調節因子 (IclR) 能夠抑制 aceBAK操縱子的表達，aceBAK操縱子編碼乙醛酸支路的3個酶：異檸檬酸裂解酶 (由aceA基因編碼)、蘋果酸合酶 (由 aceB基因編碼) 和異檸檬酸脫氫酶 (IDH) 激酶/磷酸酶 (由aceK基因編碼)。乙醛酸支路使得大腸桿菌能夠在乙酸或脂肪酸上生長。乙醛酸支路是大腸桿菌在這些碳源 (乙酸、脂肪酸) 上生長時的必需途徑，因為它避免了碳原子通過三羧酸循環而以兩分子 CO2的形式失去。乙醛酸支路激活時，異檸檬酸在異檸檬酸裂解酶催化下裂解形成乙醛酸和琥珀酸，琥珀酸可以重新進入三羧酸循環，乙醛酸和乙酰輔酶A在蘋果酸合酶的催化下形成蘋果酸[1]。乙醛酸支路的第3個酶——異檸檬酸脫氫酶 (IDH) 激酶/磷酸酶具有雙重功能，它通過磷酸化和去磷酸化異檸檬酸脫氫酶作用來控制異檸檬酸的流向[2]。

從上世紀90年代，代謝工程作為一門新的學科被提出以來[3]，代謝工程已經成當前國際生物技術領域的一個新的研究前沿。代謝流量分析作為代謝工程的一個主要的分析工具[3-4]，其結果是細胞內整個中心代謝途徑的代謝速率，也即為流量。代謝流量分析可以用來闡明細胞的代謝網絡和調控機制、提高生物生產過程的產量、注釋未知的基因、分析藥物的毒性等[5-8]。近年來，基于穩定同位素13C標記碳源的代謝流量分析方法已經成功地被應用于分析多種微生物，如大腸桿菌[9-12]、集胞藻[13]、酵母菌[14]和琥珀酸放線桿菌[15-16]等。

13C代謝流量分析實驗流程為：在培養基中添加穩定同位素13C標記的底物，如首位13C標記的葡萄糖 (1-13C-glucose) 或均勻13C標記的葡萄糖 (U-13C-glucose) 等，當細胞代謝這些13C標記的底物時，底物上的同位素標記信息會隨代謝反應從不同方向傳遞到代謝網絡的各個中間代謝物上，進而傳遞到蛋白氨基酸上。菌體蛋白氨基酸含量豐富，提取方便，且這些氨基酸是由一些關鍵的中間代謝物合成的，根據它們的同位體分布信息可以推導得到中間代謝物的同位體分布信息[17]，并借助代謝流比率方法來進行代謝流量的定量解析[18]。

當前，對細胞的中心代謝途徑基因的代謝調控研究得比較多，但對轉錄調節因子的代謝調控機理研究得則相對較少。本文主要應用13C代謝流量分析來研究iclR基因敲除對大腸桿菌BW25113生理和代謝的影響，進而揭示轉錄調節因子——異檸檬酸裂解酶調節因子在細胞代謝調控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

E. coli BW25113、E. coli BW25113 ΔiclR，由華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室保藏。iclR基因敲除的大腸桿菌菌株 E. coli BW25113 ΔiclR是在原始菌E. coli BW25113染色體上敲除了iclR基因。

1.1.2 主要試劑及儀器

均勻13C標記的葡萄糖 (U-13C-glucose，pu＞99%)、首位13C標記的葡萄糖 (1-13C-glucose，p1＞99%)、N,N-二甲基甲酰胺和衍生劑N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺均購自 Sigma公司。其他試劑均為分析純。高效液相色譜 (HPLC)為 Agilent 1200型液相。氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)為 Agilent 6890GC-5975MS型氣質聯用儀。酶標儀為BioTek Power Wave XS2型酶標儀。

1.1.3 培養基

培養基為M9合成培養基，其組成為：葡萄糖3 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，(NH4)2SO42.7 g/L，Na2HPO46.8 g/L，KH2PO43.0 g/L，NaCl 0.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，維生素B1 1.0 μg/L，微量元素溶液 10 mL/L；微量元素溶液組成為：CaCl2·2H2O 0.55 g/L，FeCl3·6H2O 1.67 g/L，MnCl2·4H2O 0.10 g/L， ZnCl20.17 g/L，CuCl2·2H2O 0.04 g/L，CoCl2·6H2O 0.06 g/L，Na2MoO4·4H2O 0.06 g/L。

1.2 培養條件及標記實驗

菌株均在37 ℃、220 r/min條件下搖瓶培養。搖瓶培養簡單易行，在指數生長期，細胞快速地消耗營養源用于新細胞體的合成，胞內代謝物幾乎沒有積累，該時期的細胞代謝處于擬穩態過程，可以對這樣的過程進行基于穩定同位素的代謝流量解析。標記實驗用20% (質量分數) 均勻13C標記的葡萄糖和 80% (質量分數) 天然的葡萄糖或者20% (質量分數) 首位13C標記的葡萄糖和80% (質量分數) 天然的葡萄糖。菌株經過活化后接種于新鮮的M9合成培養基中。取指數生長中期的細胞用于細胞內流量分析和酶活性測定，實驗重復3次，結果取平均值。

1.3 生理參數的確定

1.3.1 細胞濃度的測定

將發酵液適當稀釋后于波長600 nm處測定吸光值OD600，通過OD600的變化來監測菌體生長情況。

1.3.2 細胞干重的測定

取一定量體積的發酵液，在4 ℃下12 000×g離心10 min，用去離子水洗2次后置于85 ℃烘箱中烘至恒重，稱重。

1.3.3 葡萄糖的檢測

HPLC檢測。檢測器：示差折光檢測器；色譜柱：NH2柱；流動相：乙腈+水 (80∶20)，流速1 mL/min；檢測器池溫度：40 ℃；柱溫：40 ℃。

1.3.4 有機酸的檢測

HPLC檢測。檢測器：紫外檢測器；色譜柱：ODS柱；流動相：0.1% H3PO4，流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.3.5 生理參數的計算

基于菌體濃度、葡萄糖濃度和有機酸濃度的變化，可以計算得到指數生長期細胞的比生長速率 (μ)、菌體得率 (YX/S)、底物的比消耗速率 (qS)和產物的比生成速率 (qP)[19]。

1.4 GC-MS樣品的準備及分析

1.4.1 GC-MS樣品的準備

收集指數生長中期的菌體細胞，用 0.9% NaCl溶液清洗3次，在200 μL 6 mol/L HCl 中105 ℃水解16 h。水解產物于60 ℃真空干燥烘干，加100 μL N,N-二甲基甲酰胺和50 μL N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺85 ℃衍生1 h，衍生化的樣品過濾后用于GC-MS分析[12]。

1.4.2 GC-MS樣品的分析

氣相色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm× 0.25 μm)。升溫程序：150 ℃保留2 min，以5 ℃/min升到180 ℃，然后以10 ℃/min升到260 ℃，保留 8 min；載氣 (氦氣，純度≥99.996%) 流速為1 mL/min；進樣量：0.2 μL；分流比：1∶100；進樣口溫度：250 ℃，離子源溫度：230 ℃；?70 eV轟擊；質譜儀掃描范圍：70~560 m/z；溶劑延遲：5 min。

1.5 細胞代謝流量的定量計算

為了計算菌體細胞體內的代謝流量，我們根據大腸桿菌主要的中心代謝途徑建立了大腸桿菌的代謝模型，包括29步代謝反應和24個代謝物。在這種情形下，此代謝模型為未定系統。為了模型可解，我們可以利用實驗測得的代謝物同位體分布信息來分析代謝途徑的流量比率，進而基于細胞代謝物的平衡式以及推導得到的代謝流量比率即可進行代謝網絡反應流量的定量化分析[18]。

水解得到的蛋白氨基酸經過叔丁基二甲基硅烷化合物 (TBDMS) 衍生化處理，所得到的氨基酸衍生物就能夠在氣相色譜上得到很好的分離，在其后的質譜儀中，衍生化的氨基酸在電子轟擊離子化作用下斷裂成帶有不同碳原子骨架片段的氨基酸碎片，并且這些碎片根據質荷比的不同而得到分離[20-21]。

對于質譜得到的每個帶有不同碳原子骨架片段的氨基酸碎片，其質量分布矢量MDV可以通過公式1獲得[22]。

m0表示不含13C標記的氨基酸碎片的豐度，mi>0表示i個碳原子被13C標記的氨基酸碎片的豐度。

由于自然界中各種元素的自然豐度會對得到的氨基酸碎片的質量分布矢量 MDVα產生影響。為了得到純粹的氨基酸碳骨架的同位體質量分布矢量，MDVα需要校正掉衍生化氨基酸片段上的所有氫、氧、氮、硫、硅元素，以及衍生基團上的碳元素的自然豐度。這可以通過公式2進行校正[22]。

根據實驗得到的氨基酸碎片的質量分布矢量我們即可計算出一些節點的代謝流比率。在本研究中，乙醛酸支路是關鍵的調控途徑，Fisher等研究中僅給出了最終的計算式[23]，為了幫助理解，在這里給出其具體推導過程。目標代謝物OAA的C1到C4片段 (其質量分布矢量表示為OAA1_4) 在羧化反應中是由PEP的C1到C3片段和一分子 CO2得到 (其質量分布矢量表示為PEP1-3_CO2)， 在 乙 醛 酸 支 路 中 的 由 來(OAA_GOX) 一半為 ACA的 C1到 C2片段(ACA1_2) 和OAA的C1到C2片段 (OAA1_2) 得到 (即ACA1_2×OAA1_2)，另一半為ACA的C1到C2片段和OAA的C3到C4片段 (OAA3_4) 得到(即ACA1_2×OAA3_4)。因此能夠得到下式：

PEP1-3_CO2的計算方法可以參考筆者的另一篇文章[18]。ACA1_2可以由丙氨酸的C2到C片段的質量分布矢量得到，OAA1_2可以由天冬氨酸的C1到C2片段的質量分布矢量得到，OAA1_可以由天冬氨酸的C1到C4片段的質量分布矢量得到，OAA3_4可以由OAA1_2和OAA1_4擬合得到。考慮OAA由乙醛酸支路得到的上限，OAA1_4PEP1-3_CO2和OAA_GOX之間的關系為：化簡整理可得，來自于乙醛酸支路的OAA比率的上限為：

由得到的氨基酸片段的質量分布矢量 MDV可以計算得到中間代謝物的質量分布矢量MDV，由此可以計算得到中心代謝網絡在關鍵代謝物節點處的代謝流比率。以這些流量比率數據為輔助限制條件，結合代謝物的質量平衡關系等[24]，由MATLAB即可定量計算出細胞中心代謝途徑的代謝流量。

1.6 酶活性的測定

用于酶活測定的細胞裂解緩沖液組成：200 mmol/L Tris-HCl (pH 7)，4 mmol/L氯化鎂和2 mmol/L二硫蘇糖醇。

大腸桿菌酶液的制備：收集指數中期的細胞，4 ℃、12 000×g離心5 min收集菌體，用裂解緩沖液洗2次，然后懸浮在裂解緩沖液中，進行超聲裂解，超聲破碎條件：電壓100 V，每超聲3 s，間隔10 s，超聲20次。超聲裂解液在4 ℃、12 000×g離心5 min，上清液作為大腸桿菌粗酶液，測定上清液中的蛋白質濃度。上清液保存于?80 ℃的冰箱。

異檸檬酸裂解酶酶活性的測定[21]：反應基于異檸檬酸裂解酶催化的產物——乙醛酸和苯肼反應生成苯腙類物質，該物質在324 nm處有吸收峰。反應體系為100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH 7)、6 mmol/L氯化鎂、4 mmol/L苯肼、12 mmol/L L-半胱氨酸和8 mmol/L異檸檬酸三鈉。反應溫度：30 ℃。

2 結果與分析

2.1 iclR基因敲除對菌株生理學特性的影響

大腸桿菌原始菌和突變株的生長特性見表1。

由表1可以看出，大腸桿菌原始菌和突變株的最大比生長速率分別為0.61 h?1和0.58 h?1，iclR基因的敲除使大腸桿菌的最大比生長速率下降了5%，同時降低的還有葡萄糖的比消耗速率、乙酸的比生成速率以及乙酸得率，下降幅度分別是7%、11%和7%。大腸桿菌原始菌和突變株的菌體得率分別為 0.35 g DCW/g葡萄糖和0.37 g DCW/g葡萄糖，相對于原始菌株而言，iclR基因的敲除使突變株的菌體得率略有提高。

2.2 iclR基因敲除對細胞網絡中代謝流量比率的影響

大腸桿菌原始菌和突變株的部分TBDMS衍生化蛋白氨基酸的質量同位素分布見表2和表3。

表1 原始菌和突變株指數生長期的生長特性Table 1 Physiological characteristics of exponentially grown BW25113 and BW25113 ΔiclR

表2 大腸桿菌原始菌TBDMS衍生化蛋白氨基酸的質量同位體分布 (已校正)Table 2 Mass isotopomer distributions of E. coli BW25113 TBDMS-derivatized proteinogenic amino acids (corrected)

表3 大腸桿菌突變株TBDMS衍生化的蛋白氨基酸的質量同位體分布 (已校正)Table 3 Mass isotopomer distribution of E. coli BW25113 ΔiclR TBDMS-derivatized proteinogenic amino acids (corrected)

根據大腸桿菌原始菌和基因缺陷株的TBDMS衍生化的蛋白氨基酸的質量同位體分布，可以計算得到2種菌株細胞中合成若干關鍵代謝物節點的代謝途徑的相對流量分布，也即代謝流比率 (圖1)。

由圖1可以看出，iclR基因敲除的大腸桿菌中丙酮酸由 ED 途徑得到的比率(f_Pyr_from_ED) 顯著增大、草酰乙酸由乙醛酸之路得到的上限顯著變大、磷酸烯醇丙酮酸由戊糖磷酸途徑得到的上限變小，而其他流比率變化不明顯。丙酮酸由蘋果酸得到的上下限均接近于零，說明在葡萄糖作為碳源的情況下，大腸桿菌原始菌和ΔiclR敲除菌中蘋果酸酶催化反應的活性均極為低下。

圖1 大腸桿菌原始菌和ΔiclR突變株的代謝流比率Fig. 1 Flux ratios at several key metabolic nodes in E. coli BW25113 and E. coli BW25113 ΔiclR. a: f_PEP_ from_glycolysis; b: f_Pyr_from_ED; c: f_OAA_from_ PEP; d: f_PEP_from_OAA; e: f_Pyr_from_Mal_ub; f: f_Pyr_from_Mal_lb; g: f_OAA_from_glyoxylate_ub; h: f_PEP_from_PP_ub; lb: lower bound; ub: upper bound.

2.3 iclR基因敲除對菌體代謝流分布的影響

為了了解 iclR基因敲除對大腸桿菌整個中心代謝途徑的影響，可以基于所得到的代謝流比率結果、菌體的生理學參數以及細胞的代謝網絡模型來計算整個中心代謝途徑中的凈反應流量，并以此解析相關代謝反應特性。

大腸桿菌原始菌和ΔiclR突變株的中心代謝流量分布情況如圖2所示。

圖2 原始菌和突變株的代謝流分布 (數值表示計算得到的凈流量，其值以葡萄糖比消耗速率 (單位以mmol/(g DCW·h)) 為基準)Fig. 2 Metabolic flux distribution of E. coli BW25113 and BW25113 ΔiclR. The numbers are net fluxes determined. The flux values are expressed relative to the specific glucose uptake rate as indicated in parentheses (in mmol/(g DCW·h)).

由圖2可以看出，iclR基因敲除大腸桿菌乙醛酸支路得到了激活，異檸檬酸分子有33%經乙醛酸支路分解得到琥珀酸和乙醛酸，流經 TCA循環的流比率變小，糖酵解途徑流量比率變化不大，PP途徑流比率變小，而草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的流量基本不變。

2.4 iclR基因敲除對菌體酶活性的影響

為了進一步確認 iclR基因敲除大腸桿菌乙醛酸支路是否得到激活，測定了乙醛酸支路關鍵酶之一的異檸檬酸裂解酶的活性 (圖3)。由圖可以看出，iclR基因的敲除成功地解除了對異檸檬酸裂解酶表達的抑制作用，從而使該酶活得到了顯著提高，提高了60倍以上。

圖3 大腸桿菌原始菌和突變株中異檸檬酸裂解酶活性的比較Fig. 3 Comparison of enzyme activity of isocitrate lyase in E. coli BW25113 and BW25113 ΔiclR.

3 討論

為了闡明iclR基因敲除對大腸桿菌的影響，我們考察了糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、Entner-Doudoroff途徑、三羧酸循環、乙醛酸支路在內的細胞中心代謝途徑中的代謝流量分布情況，并同時測定了乙醛酸支路關鍵酶之一的異檸檬酸裂解酶的活性。綜合以上得到的信息，為理解突變菌株的內在代謝調控特點和規律提供相應的理論基礎。

有報道稱乙醛酸支路的活性依賴于細菌的代謝狀態，在一些碳源條件下，如葡萄糖和丙酮酸條件下，乙醛酸支路是不激活的[25]。另外，有文獻報道通過酶活測定等方法得到：當 iclR 基因敲除時乙醛酸支路得到了激活[26-27]。然而，基于酶活性或代謝物分析等常規方法難以真正判斷細胞內乙醛酸支路反應的的活躍程度[18]。本研究通過基于穩定同位素13C的代謝反應流量分析并結合酶活性測定，系統地確定了大腸桿菌原始菌在葡萄糖上代謝時乙醛酸支路活性的缺乏，而iclR基因的敲除有效地激活了大腸桿菌的乙醛酸支路反應，研究同時表明約有33%的異檸檬酸通過乙醛酸支路進行代謝。

在我們得到上述研究結果的同時，Waegeman等[28]分別利用均勻13C標記葡萄糖/天然葡萄糖 (20%∶80%，W∶W) 以及首位13C標記葡萄糖/天然葡萄糖 (50%∶50%，W∶W) 的混合葡萄糖作為底物研究大腸桿菌 K12 MG1655 ΔiclRΔarcA菌株在葡萄糖豐富培養基上的代謝，同樣得到了乙醛酸支路被激活、30%異檸檬酸通過乙醛酸支路代謝，以及菌體得率得到很大提高等相似結論。

另有研究表明大腸桿菌在特定條件下會激活磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循環[29]。iclR基因敲除的大腸桿菌中，乙醛酸支路得到了激活，但研究表明草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶反應流量基本不變，說明 iclR基因的敲除不會明顯影響未激活磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循環，碳原子沒有過多地通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶反應以 CO2形式排出而得以保留。乙醛酸支路的激活，異檸檬酸通過TCA循環的相對流量變小，以及PP途徑相對流量變小等使得CO2的釋放量減少，另外，突變株乙酸的得率亦變小，這些原因就使得iclR基因敲除菌的菌體得率有所變大。

iclR基因敲除菌的乙酸關于葡萄糖的得率減小。大腸桿菌中乙酸產生的原因一般是“溢出代謝”[30]的結果，是由于葡萄糖的攝取及細胞生物合成和能量需要之間的不平衡造成的[31-32]。大腸桿菌可以通過降低葡萄糖的利用速率或者促進菌體的代謝來減少乙酸的產生[32]。突變株的葡萄糖比消耗速率較原始菌的小，另外，突變株乙醛酸支路的激活使得乙酰輔酶A的代謝效率更高，兩方面的原因使得ΔiclR突變株的乙酸得率略低于原始菌株。

本研究通過基于穩定同位素13C的細胞內代謝反應流量定量解析，同時結合酶活檢測等初步分析了轉錄調節因子異檸檬酸裂解酶調節子在大腸桿菌細胞代謝中的作用。該研究提供的利用代謝流量比率作為限制條件的代謝反應流量分析方法可以廣泛地應用到更多的細胞體系和生物過程中，用以輔助對細胞特定基因功能以及代謝調控機理的闡明。

附錄1 大腸桿菌中心代謝網絡化學計量反應式Appendix 1 The central metabolic network in Escherichia coli with the stoichiometric reactions

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