豬鏈球菌的分離鑒定及對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性

劉 靜，李賢賢，張 鵬，王淑杰，吳 悅，趙玉蓮，李 鶴，李艷華

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾北安管理局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 北安 164095；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150030）

豬鏈球菌病是一種人畜共患的傳染性疾病，在世界上廣泛分布，是由C、D、L群鏈球菌引起的豬多種疾病的總稱，在臨床上主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)膿腫等癥狀。其中，豬鏈球菌是引起豬鏈球菌病最主要的病原，引起豬腦膜炎以及敗血癥等疫病，人通過特定的傳播亦可感染該菌［1－2］。近幾年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的不斷提高，豬鏈球菌病發(fā)生呈明顯上升趨勢(shì)，且常與豬繁殖障礙及呼吸道綜合征、豬附紅細(xì)胞體病、非典型豬瘟、豬圓環(huán)病毒病混合感染，一旦發(fā)生很難控制，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。雖然理論上有很多藥物能治療豬鏈球菌病，但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及不合理用藥，使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重［4－5］。為此，我們對(duì)黑龍江省某豬場(chǎng)采集的豬鼻腔棉拭子進(jìn)行豬鏈球菌分離純化、生化鑒定和PCR鑒定，并對(duì)分離菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以期為豬鏈球菌病的防治工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及病料 標(biāo)準(zhǔn)2型豬鏈球菌菌株ATCC700794、ATCC19714，購自美國疾病控制中心。病料系從黑龍江省某豬場(chǎng)通過滅菌棉拭子采集的豬鼻腔分泌物。

1.2 培養(yǎng)基 腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂，購自中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 藥物 青霉素 G（Penicillin G，PEN）、阿莫西林（Amoxicillin，AMO）為東北制藥總廠生產(chǎn)；頭孢唑啉（Cefazolin，CEZ）、頭孢噻呋（Ceftiofur，CEF）、頭孢西?。–efoxitin，F(xiàn)OX）為石藥集團(tuán)中潤(rùn)制藥（內(nèi)蒙古）有限公司生產(chǎn)；紅霉素（Erythromycin，ERY），購自武漢遠(yuǎn)鴻科技開發(fā)有限公司；氧氟沙星（Ofloxacin，OF），購自河南康泰藥業(yè)有限公司；磺胺甲口惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ），購自上海元越化工有限公司。上述藥品配制成一定濃度后于－20℃保存，1周內(nèi)使用，臨用前稀釋成使用濃度。8類抗菌藥物試驗(yàn)所用藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 分離鑒定

1.4.1 細(xì)菌分離純化 用無菌接種環(huán)蘸取病料接種于匹克氏肉湯中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h后，將其接種于腦心浸液瓊脂平板上，再次置37℃培養(yǎng)24 h后，挑取平板上表面光滑、灰白透明單個(gè)可疑菌落接種于腦心浸液肉湯做純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行革蘭染色，觀察其形態(tài)和染色特性。

1.4.2 生化試驗(yàn) 用分離菌純培養(yǎng)物分別接種于乳糖、蔗糖、山梨醇、棉子糖、葡萄糖、甘露醇、菊糖、水楊苷、七葉苷、馬尿酸鹽、蕈糖、6.5%NaCl等微量生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察其生化反應(yīng)特性。

1.4.3 PCR鑒定 參照文獻(xiàn)［6］合成引物，gdh U：5′-GCAGCGTATTCTGTCAAAC G-3′ 和 gdh L：5′-CCATGGACAGATAAAGATGG-3′，擴(kuò) 增 片 段大小為688 bp，對(duì)10株分離株分別進(jìn)行g(shù)dh基因檢測(cè)。PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 變性5min；94℃45 s，55℃45 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.5 藥敏試驗(yàn)

1.5.1 K-B試驗(yàn) 采用K-B紙片法。將分離的豬鏈球菌接種于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。比濁法將菌液濃度先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?.5×108CFU／m L），然后用腦心浸液肉湯培養(yǎng)基稀釋至濃度約為1.5×105CFU／m L。取1.5×105CFU／m L菌液100μL接種于腦心浸液瓊脂平板上，用涂布棒均勻涂開，

然后將藥敏紙片貼于平板上，兩片之間的距離以1～2 cm為宜，紙片距平皿邊緣約1.5 cm，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后，測(cè)定抑菌圈的直徑，并用美國NCCLS標(biāo)準(zhǔn)（1999～2001）對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定［7］。

1.5.2 體外最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 嚴(yán)格按照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)［7］推薦的標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋法進(jìn)行，首先將分離的豬鏈球菌菌液濃度調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?.5×108CFU／m L），然后用腦心浸液肉湯培養(yǎng)基稀釋至濃度約為1.5×105CFU／m L后，將菌液接種于含不同藥物濃度的96孔板中，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，計(jì)算細(xì)菌對(duì)各抗菌藥物的耐藥率。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)及染色鏡檢 從采集的病料中分離得到10株革蘭陽性球菌，分別將其編號(hào)為：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。分離菌在腦心浸液瓊脂平板上菌落呈半透明、表面光滑、微隆起的淡灰白色狀的小菌落；鏡檢呈單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的革蘭陽性球菌。

2.2 生化試驗(yàn) 對(duì)分離到的10株革蘭陽性球菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，生化反應(yīng)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，鑒定結(jié)果見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR鑒定結(jié)果 以分離株基因組DNA為模板經(jīng)PCR檢測(cè)后，10株分離菌株gdh基因的檢測(cè)結(jié)果均為陽性（圖1），確定為豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖1 豬鏈球菌菌種PCR鑒定結(jié)果

2.4.1 K-B試驗(yàn)結(jié)果 分離自豬場(chǎng)的10株豬鏈球菌對(duì)各抗菌藥物的耐藥結(jié)果顯示，所有的菌株對(duì)8種藥物有不同程度的敏感性，但所有的菌株均對(duì)青霉素G、阿莫西林敏感；而對(duì)頭孢西丁、紅霉素、磺胺甲口惡唑3種藥物100%耐藥。結(jié)果見表2。

表2 10株豬鏈球菌分離株的藥敏檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 體外最小抑菌濃度的結(jié)果 根據(jù)NCCLS的判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，8種抗生素中，對(duì)豬鏈球菌抑菌作用最強(qiáng)的是青霉素G、阿莫西林，高度敏感株達(dá)100%。頭孢唑啉、頭孢噻吩對(duì)菌株敏感度在40%～80%之間。而頭孢西丁、紅霉素、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑敏感度為0%。結(jié)果見表3。

表3 8種抗菌藥物對(duì)10株豬鏈球菌分離株的MIC測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)從采集的豬鼻腔分泌物中分離到的10株細(xì)菌，根據(jù)培養(yǎng)特性、染色特點(diǎn)、形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)及PCR鑒定確定為豬鏈球菌。本試驗(yàn)表明該豬場(chǎng)已出現(xiàn)豬鏈球菌感染。豬鏈球菌是一種能引起人、豬和其他動(dòng)物感染、發(fā)病的重要致病菌。據(jù)報(bào)道，豬鏈球菌血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病豬中經(jīng)常流行的血清型，其中以2型流行最廣、致病性最強(qiáng)，從發(fā)病動(dòng)物中有較高的分離率。但不同血清型菌株之間毒力有較大差異，并非所有的血清型均具有致病性，其與動(dòng)物致病性有很大關(guān)系［8］。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)豬鏈球菌分離株進(jìn)行的PCR分型鑒定卻未能檢測(cè)出上述血清型。為了有利于此病的控制，仍需作進(jìn)一步細(xì)致的研究。

本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，豬鏈球菌分離株對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素G、阿莫西林、頭孢唑啉、頭孢噻呋的敏感性較高，其中青霉素G、阿莫西林抗菌活性最高，可作為該豬場(chǎng)防治豬鏈球菌病的首選藥物，但是對(duì)頭孢西丁產(chǎn)生了明顯的耐藥性。此外，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，大部分菌株具有多重耐藥性，所有分離株對(duì)紅霉素、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑的耐藥性尤為嚴(yán)重。其與我國其他學(xué)者在東北地區(qū)對(duì)豬鏈球菌耐藥菌株所作的耐藥性研究相符［9－10］。由此表明，本地區(qū)的豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物、喹諾酮類藥物和磺胺類藥物可能產(chǎn)生了高耐藥性。

豬鏈球菌菌株對(duì)抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生，一方面由于抗菌藥物長(zhǎng)期應(yīng)用導(dǎo)致的“選擇性壓力”篩選和抗菌藥物的不合理使用加速細(xì)菌發(fā)生基因突變獲得耐藥性除外，耐藥基因在菌株中的廣泛傳播至關(guān)重要［11－12］。國外的研究表明，細(xì)菌能通過攜帶可轉(zhuǎn)移遺傳因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體和整合子基因盒系統(tǒng)等使耐藥性擴(kuò)散傳播，其中整合子潛在的基因捕獲及整合表達(dá)能力，對(duì)細(xì)菌耐藥性傳播可能是一種更為嚴(yán)重的威脅［13－15］。而這種擴(kuò)散傳播可能發(fā)生在土壤內(nèi)，也可能是發(fā)生在人類或動(dòng)物腸道內(nèi)。1959年醫(yī)務(wù)人員已開始認(rèn)識(shí)到在志賀氏菌中發(fā)現(xiàn)的耐藥基因可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至大腸埃希氏菌中。本試驗(yàn)研究的豬鏈球菌，有人報(bào)道過其是通過轉(zhuǎn)座子Tn1545在菌間傳播的［16］。由此表明耐藥不僅存在于致病菌中，也存在于共生菌中，而且在食物、環(huán)境和動(dòng)物中存在。

豬鏈球菌是革蘭陽性菌，從理論上講，其抵抗力不強(qiáng)，在治療上，很多藥物對(duì)其都有療效，但近年來由于抗生素的濫用，如在動(dòng)物飼料中長(zhǎng)期添加抗生素用于促進(jìn)生長(zhǎng)及預(yù)防和治療疾病，發(fā)生疾病后未經(jīng)獸醫(yī)診斷就盲目使用大量多種抗菌藥物等，在抗菌藥物的選擇壓力下，豬鏈球菌產(chǎn)生了大量耐藥菌株。因此，建議豬場(chǎng)在防治豬鏈球菌病時(shí)，最好先做藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，選用兩種或兩種以上的敏感藥物交替使用。其不僅可以防止抗藥菌株的產(chǎn)生，指導(dǎo)臨床用藥，而且對(duì)于預(yù)防豬鏈球菌繼發(fā)感染，有效降低這些疾病造成的損失同樣具有重要指導(dǎo)意義。

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