內(nèi)毒素對(duì)肉雞腸黏膜及肝線粒體復(fù)活體Ⅰ活性的影響及氨基胍的保護(hù)效應(yīng)

王 巖，石冬梅，向瑞平，皇甫和平，張 華，唐兆新，徐家華，王友令，張 勝

（1.鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校，河南 鄭州 450011；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

內(nèi)毒素 （endotoxin）是指革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）成分［1］。在獸醫(yī)臨床中，由于抗生素或補(bǔ)體復(fù)合物的大量使用，使大腸桿菌、沙門菌等革蘭陰性菌死亡裂解，釋放出內(nèi)毒素［2］。內(nèi)毒素脂多糖（LPS）可引起組織缺血，改變?nèi)苊阁w內(nèi)過(guò)氧化物及線粒體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)，消耗大量ATP，使鈣泵活性下降，并阻礙呼吸鏈的傳遞，介導(dǎo)質(zhì)子過(guò)氧化反應(yīng)，促進(jìn)氧自由基的形成，進(jìn)一步損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)［3］。內(nèi)毒素血癥是導(dǎo)致革蘭陰性桿菌病抗生素治療失敗和家禽業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一［4］。因此，闡明其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的防治方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 本試驗(yàn)所用嶺南黃羽肉雞，均購(gòu)自廣東省畜牧研究所孵化廠，自由采食和飲水，至30日齡，從中選出個(gè)體體重差異不顯著的黃羽肉雞90只，隨機(jī)分成3組，每組肉雞隨機(jī)分成5小組，每小組6只。生理鹽水對(duì)照組（30只），分別每只翅靜脈注射生理鹽水2 m L；LPS組（內(nèi)毒素組）（30只），分別每只翅靜脈注射5 mg／kg LPS；AG＋LPS組（氨基胍治療組）（30只），分別每只翅靜脈注射300 mg／kg的AG，1 h后再分別翅靜脈注射5 mg／kg LPS。

1.2 樣品采集處理與線粒體的提取 各小組分別在處理后1、3、5、7、9 h的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣。用苯巴比妥鈉翅靜脈注射麻醉，剖腹取肝臟和十二指腸黏膜放入樣品袋中，標(biāo)明樣品名稱和編號(hào)，立刻投入液氮中速凍，再置于－80℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?］。線粒體分離方法按藏瑩安方法提取，置于－80℃超低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?］。

1.3 線粒體復(fù)合體Ⅰ的測(cè)定方法 分別取1 mol／m L Tris-HCl 50μL、1.3 mol／m L DCIP 50μL，、雙蒸水850μL左右，加入到紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)比色皿中（30℃，溫?。?，再加入15 mmol／L的 NADH 50μL，用移液槍吹打多次，使其充分混勻，同時(shí)做一對(duì)照比色皿，立刻在600 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行時(shí)間掃描，掃描時(shí)間為300 s，當(dāng)掃描45 s后，立刻打開(kāi)分光光度計(jì)比色池的蓋子，在樣品比色皿中加入10～50μL的線粒體樣品，加完后，用移液槍快速吹打幾下，立刻蓋住蓋子繼續(xù)進(jìn)行時(shí)間掃描，并得到酶動(dòng)力學(xué)曲線［7］。

線粒體復(fù)合體Ⅰ活力的計(jì)算：復(fù)合體Ⅰ活力＝（△A／min sample－△A／min blank）÷21÷（取樣量×蛋白含量）

1.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算各組不同時(shí)間平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，通過(guò)Ducans新復(fù)極差檢驗(yàn)法（DMRT法）比較各組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸黏膜線粒體復(fù)合體Ⅰ活性的測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)圖1。

由圖1可知，分別用AG＋LPS及LPS處理后，LPS組肉雞腸黏膜線粒體復(fù)合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低再上升的動(dòng)態(tài)變化曲線，5 h時(shí)線粒體復(fù)合體Ⅰ活性達(dá)到最高，7 h時(shí)后線粒體復(fù)合體Ⅰ活性下降，9 h時(shí)又升高；與生理鹽水組相比，各時(shí)間點(diǎn)線粒體復(fù)合體Ⅰ活性均顯著低于生理鹽水對(duì)照組（P＜0.05）。AG＋LPS組肉雞腸黏膜線粒體復(fù)合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化曲線，3 h時(shí)線粒體復(fù)合體Ⅰ活性最高，隨后逐漸降低；與生理鹽水組相比，各時(shí)間點(diǎn)線粒體復(fù)合體Ⅰ活性均顯著低于生理鹽水組（P＜0.05）；與LPS組相比，在1、3 h時(shí)，線粒體復(fù)合體Ⅰ活性均顯著高于LPS組（P＜0.05），在5、7 h時(shí)，線粒體復(fù)合體Ⅰ活性與LPS組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），直到9 h時(shí)，線粒體復(fù)合體Ⅰ活性卻又顯著低于LPS組。

圖1 LPS和AG＋LPS對(duì)肉雞腸黏膜線粒體復(fù)合體Ⅰ活力的動(dòng)態(tài)變化曲線

2.2 肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性的測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)圖2。

由圖2可知，分別用LPS＋AG及LPS處理后，LPS組肉雞肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低再上升的動(dòng)態(tài)變化曲線，5 h時(shí)肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性達(dá)到最高，7 h時(shí)后下降，9 h時(shí)又升高；與生理鹽水組相比，各時(shí)間點(diǎn)肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性均顯著低于生理鹽水對(duì)照組（P＜0.05）。AG＋LPS組肉雞肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性呈現(xiàn)先升高后降低的動(dòng)態(tài)變化曲線，3 h時(shí)肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性最高，隨后逐漸降低；與生理鹽水組相比，除3 h時(shí)肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性與生理鹽水組之間差異不顯著 （P＞0.05）外，其余各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于生理鹽水組（P＜0.05）；與LPS組相比，在1、3 h時(shí)，肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性均顯著高于LPS組（P＜0.05），在5、7 h時(shí)，肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性與LPS組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），直到9 h時(shí)，肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ活性卻又顯著低于LPS組。

圖2 LPS和AG＋LPS對(duì)肉雞肝線粒體復(fù)合體Ⅰ活力的動(dòng)態(tài)變化曲線

3 討論

AG對(duì)LPS毒害的線粒體復(fù)合體Ⅰ活性的作用線粒體是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的細(xì)胞器，是產(chǎn)生能量的場(chǎng)所，其病變影響到細(xì)胞各成分的協(xié)調(diào)并危及細(xì)胞生命活動(dòng)［3］。同時(shí)線粒體也是程序化死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器［8－9］。線粒體復(fù)合體Ⅰ是線粒體電子傳遞鏈中5個(gè)復(fù)合體中較為重要的一個(gè)，其功能在于催化位于線粒體基質(zhì)中由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的NADH＋H＋中2個(gè)H＋經(jīng)FMN轉(zhuǎn)運(yùn)到膜間空間，同時(shí)再經(jīng)過(guò)Fe-S將2個(gè)電子傳遞到輔酶Q（UQ）。內(nèi)毒素休克時(shí)，細(xì)胞能量生成障礙，其原因是線粒體內(nèi)膜氧化磷酸化功能障礙。研究表明，內(nèi)毒素作用下6h，幼鼠腸黏膜線粒體腸上皮細(xì)胞線粒體不同程度腫脹，嵴不清，空泡樣改變明顯，微絨毛排列不整、部分?jǐn)嗔选⒉糠志o密連接增寬等病理性損害，證明內(nèi)毒素對(duì)腸黏膜的損傷［10］。大鼠在發(fā)生內(nèi)毒素血癥時(shí)，肝線粒體質(zhì)子跨膜能力下降，電子傳遞鏈中50%的復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性降低；肝線粒體偶聯(lián)程度下降，線粒體內(nèi)膜電子傳遞障礙［11］。

本試驗(yàn)研究表明，LPS顯著降低了各時(shí)間段肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性，這可能是由于LPS誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了大量自由基，攻擊線粒體膜間的電子傳遞鏈，線粒體復(fù)合體Ⅰ受損傷，使其活性下降，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜氧化磷酸化功能障礙，ATP生成減少；到了后期，隨著LPS在體內(nèi)代謝的增加，含量減少，機(jī)體內(nèi)抗氧化能力代償性回升，自由基生成減少，線粒體復(fù)合體Ⅰ的活力也代償性緩慢回升。注射AG＋LPS 1 h時(shí)，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性未發(fā)生變化，3 h時(shí)卻顯著增加了肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性，這是由于AG對(duì)LPS具有明顯的頡頏作用，使LPS未能充分發(fā)揮誘導(dǎo)自由基的作用，從而使線粒體復(fù)合體Ⅰ受到損傷程度大大減少，其活性變化減少；5、7 h時(shí)，隨AG的消耗，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性趨于正常；9 h時(shí)，AG消耗殆盡，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性顯著降低。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS在各時(shí)間段顯著降低了肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性（P＜0.05）。AG在3 h時(shí)卻顯著增加了肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性（P＜0.05），在9 h時(shí)，肉雞腸黏膜線粒體和肝臟線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)了線粒體的損傷，引起了能量代謝障礙，ATP生成減少；AG對(duì)LPS具有明顯的頡頏作用，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。

［1］趙永亮.內(nèi)毒素血癥特異抗體治療［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢測(cè)分冊(cè)，2002，23（3）：170-172.

［2］王雪欣，錢元恕.抗生素誘導(dǎo)內(nèi)毒素釋放的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)），2002，23（4）：170-173.

［3］黃永坤.胃腸黏膜屏障功能障礙及腸道細(xì)菌或內(nèi)毒素移位對(duì)機(jī)體的影響［J］.臨床兒科雜志，2010，28（10）：908-911.

［4］王永堂，魯秀敏，伍亞民.細(xì)菌內(nèi)毒素與抗內(nèi)毒素治療［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2002，23（5）：266-269.

［5］Markley Michele A，Pierro Agostino，Eaton Simon.Hepatocyte mitochondrial metabolism is inhibited in neonatal rat endotoxaemia：Effects of glutamine［J］.Clinical Science（London），2002，102（3）：337-344.

［6］臧瑩安，丁發(fā)源，向瑞平，等.從動(dòng)物組織中提取線粒體的方法［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006，42（2）：61-62.

［7］Tang Z，Iqbal M，Cawthon D，etal.Heart and breast muscle mitochondrial dysfunction in pulmonary hypertension syndrome in broilders［J］.Comparative Biochemiastry and Physiology part A，2002，132：527-540.

［8］夏晨梅，張順財(cái).內(nèi)毒素血癥致肝臟損傷［J］.肝臟，2008，13（2）：162-163.

［9］劉春峰，李巍，袁壯，等.SIRS大鼠心肌葡萄糖-6-磷酸酶活性的測(cè)定和線粒體肜態(tài)變化［J］.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2001，1（6）：147-149.

［10］李軍，許玲芬，孫梅.谷氨酰胺對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)幼鼠腸損傷的保護(hù)作用［J］，中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14（3）：30-32.

［11］Cawthon D，Bottje W.Locaized defects in the electron transport chain（ETC）and alterations of pronton leak may underlie ascites-associated mitochondrial dysfunction in broilers［J］.Poultry Science，1999，78（suppl.1）：30.