單核細胞增生性李斯特菌分離株的生物學特性研究

吳曉薇，徐成剛，張朝冠，江經緯，葉賀佳，區燕宜，徐小芹，廖 明

（1.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642；2.廣東檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623；3.廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東 廣州 510642；4.南海出入境檢驗檢疫局，廣東 佛山 528200）

單核細胞增生李斯特菌（L.monocytogens，LM）廣泛存在于自然界，可導致人和動物腦膜炎、流產、敗血癥等，病死率高達30%～70%，是目前人類最重要的食物源性病原菌之一［1－3］，也被列為21世紀對中國人衛生健康具有重大影響的12種病原微生物之一［2］。近年來，許多國家報道，從多種食品中分離到李斯特菌或食品污染李斯特菌而引起的食物中毒暴發事例，已引起了公共衛生部門的廣泛關注［2－4］，許多國家都加強了對該菌的檢測及研究。

為了解廣州地區的禽產品中LM的污染情況，課題組采集不同地點和來源的各種禽產品，分離到6株LM。本文進一步進行研究了6株LM分離株生物學特性，為預防廣州地區李斯特菌病的暴發、流行及防制提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 LM標準菌株C53003、C53005，購自中國藥品生物制品檢定所。6株從廣州禽產品中分離的LM，分別命名為47LM、233LM、374LM、776LM、809LM株和814LM。

1.2 實驗動物 體重為16～18 g的SPF級BABL／c小鼠，購自中山醫科大學實驗動物中心；10日齡健康粵黃雞，購自華南農業大學實驗種雞場；體重為3 kg左右清潔級新西蘭公兔，購自南方醫科大學實驗動物中心。

1.3 試劑 氯霉素、卡那霉素、頭孢唑啉、慶大霉素、痢特靈、阿莫西林、環丙沙星、頭孢孟多、新霉素、壯觀霉素、丁胺卡那霉素、頭孢拉定、氟派酸、紅霉素、利福平、鏈霉素、青霉素G、復方新諾明、多黏菌素B和新生霉素藥敏紙片為杭州天和生物制品科技有限公司產品。

1.4 藥敏試驗 按常用的擴散法藥敏試驗（Kirby－Bauer法3）進行。采用WHO質控標準菌的敏感性及抑菌環大小采用劃分方法報告結果。

1.5 p H值對分離株生長的影響 按照TSB-YE使用說明稱量配制后，按要求用10%氫氧化鈉溶液或鹽酸調節p H 值，配制p H 值分別為2.0、3.0、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.5、11.0的培養液，高壓滅菌。將LM分離株接種于一系列TSB-YE中，35℃培養24～48 h，觀察其生長情況，判斷能使LM生長的p H值。同時設相應的陰性對照。1.6 動物致病性試驗 將LM分離菌株分別接種TSB-YE，35℃培養24 h后，以2 500 r／min離心30 min，棄去上清液，用滅菌生理鹽水制成濃度約為1010CFU／m L。通過腹腔注射途徑感染5只體重為16～18 g SPF級BABL／c小鼠、通過點眼途徑感染3只清潔級的新西蘭公兔、通過肌肉注射途徑感染10只健康黃雞，各0.1 m L（約109CFU）。同時用標準株C53005英諾克李斯特菌作陽、陰性對照。攻毒后連續觀察7～10 d，記錄小鼠、兔、雞的癥狀及死亡情況。

1.7 分離株的分子生物學特性研究 參照吳曉薇等［5］方法克隆6株分離株Hly基因，并送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。借助DNAStar 5.07分析軟件，將標準株C53005株和C53003及LM分離株的Hly基因序列與GenBank上的LM基因的序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 藥敏試驗結果 LM分離株對20種抗生素的藥敏試驗的結果表明，6株LM分離株對先鋒必、氯霉素、卡那霉素、頭孢唑啉、慶大霉素、壯觀霉素、丁胺卡那霉素、氟哌酸、紅霉素、利福平、鏈霉素、青霉素G均敏感；對環丙沙星、痢特靈、頭孢孟多有中度敏感；對多黏菌素B、復方新諾明，新生霉素，新霉素有耐藥性。6株分離株與標準菌株藥物敏感譜基本相似。但是各分離株之間也有一定的區別，個別分離株對某些藥物會產生的耐藥性，如374LM分離株對新霉素就產生的耐藥性。

2.2 LM分離株在不同的p H值TSB-YE中生長情況 6株分離株和標準株在不同的p H值TSBYE培養液生長情況結果表明，標準株C53005 p H值范圍為3.8～10.5，LM分離菌47、776、814的p H值范圍為4.2～10.5，LM分離菌233、374的p H值范圍為4.0～10.0，LM分離菌809的p H值范圍為4.0～10.5。LM分離株的p H值適應范圍比標準株略窄。

2.3 動物致病性試驗 小鼠接種菌液24～72 h內，呈現不同的死亡情況，其中標準株C53005作陽性對照組，47LM分離株、374LM分離株和814LM分離株對小鼠表現出較強的毒力，小鼠在24 h內全部死亡；223號和809號菌株對小鼠表現出中等的毒力，在48 h內全部死亡；776菌株有一定的致病力，在72 h內全部死亡，剖檢死亡小鼠，可見到肝臟有點狀或斑狀灰白色壞死灶。陰性對照組沒有小鼠的死亡。LM分離株的小鼠攻毒試驗具體的結果見表1。

表1 LM分離株的小鼠攻毒實驗結果

用6株分離株對新西蘭公兔攻毒后18～24 h內感染兔會出現明顯的的膿性結膜炎，24～72 h之內會越來越嚴重，到第7天以后分泌物減少，結膜炎癥和角膜仍然渾濁。10 d兔的眼結膜基本恢復。陽性對照組的兔同樣出現這樣的情況，陰性對照組的兔沒有出現異常情況。

用6株LM分離株對健康黃雞接種后，試驗雞、陽性對照組和陰性對照組的雞沒有出現異常情況。

2.4 分離株分子生物學特性 借助DNAStar 5.07分析軟件，將6株分離株的Hly基因序列與標準株C53005株和C53003及GenBank上DQ054589、DQ8411418和EF182456的LM基因的序列進行同源性比較。結果顯示，Hly基因與參考株相比具有高度的同源性，達96.1%～100%，見圖1。

圖1 分離株Hly基因的同源性比較

3 討論與結論

食源性致病菌的耐藥性對食品安全及人類健康的影響已經引起許多國家的警惕［6－7］。6株分離LM株對多黏菌素B、復方新諾明、新生霉素、新霉素有耐藥性，與巢國祥、趙悅等研究結果相似［6－7］。禽產品分離株耐藥性嚴重，這主要是由于生產過程中抗生素的使用造成的嚴重選擇壓力所致［7］。美國FDA和部分歐洲國家曾允許使用抗生素作為動物飼料添加劑，造成動物源性食品中分離株耐藥性大幅提升，基于這一現狀，2006年歐盟禁止使用抗生素作為動物飼料添加劑［8］。LM耐藥性的發展對疾病治療將是嚴重的挑戰，對LM耐藥性的發展趨勢應該引起關注。

本研究的結果顯示，LM分離株p H值的適應范圍為4.0～10.5，說明LM對酸堿有較強的抵抗力和耐受力，這與楊正時等研究結果一致［9］。

6株分離株的Hly基因序列與與參考株相比具有高度的同源性，達96.1%～100%。該基因是LM的主要毒力基因，關系到LM的毒力的強弱［2，4］，該基因的遺傳變異小，更有利于細菌毒力變異的研究。同時該基因的變異小，但是不同菌株毒力有一定的差異，說明了LM毒力是該基因與其他基因協同作用結果。

［1］Bhasin S K，Chaturvedi S，Sharma A K，etal.Knowledge amongst adult population regarding vectors of malaria in 21 states of India［J］.J Commun Dis，2001，33（4）：286-296.

［2］蔣原.食源性病原微生物檢測指南［M］.北京：中國標準出版社，2010：113-115.

［3］Nightingale K K，Windham K，Wiedmann M.Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods［J］.J Bacteriol，2005，187（16）：5537-5551.

［4］牛華星，肖永霞，尹旭升，等.單核細胞增多性李斯特菌的毒力因子及檢測研究進展［J］.畜牧與飼料科學，2009，30（1）：6-7.

［5］吳曉薇，徐成剛，馬保華，等.單增李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表達［J］.中國動物檢疫，2011，28（8）：46-50.

［6］巢國祥.8類食品單核細胞增生李斯特菌流行特征及耐藥性狀研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2005，15（5）：519-521.

［7］趙悅，付萍，裴曉燕，等.中國食源性單核細胞增生李斯特菌耐藥特征分析［J］.中國食品衛生雜志，2012，24（1）：5-8.

［8］Lungu B.Listeria monocytogenes：Antibiotic resistance in food production［J］.Foodforne Pathogens Dis，2010，6：1089-1096.

［9］楊正時，房海.人及動物病原細菌學［M］.石家莊：河北科技出版社，2003：884-894.