宜賓芽菜發(fā)酵菌種的優(yōu)選

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢 643000）

宜賓芽菜是四川著名的“四大醬腌菜”之一，以小葉芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.var.foliosaBailey〕的葉柄剖絲，晾至余葉漸枯，再配以佐料腌制而成。宜賓芽菜在長期的發(fā)展過程中，在產(chǎn)地自然環(huán)境和人文因素的共同影響下，逐漸形成了香、甜、脆、嫩、鮮的獨特風味，成為家喻戶曉的傳統(tǒng)醬腌菜。

宜賓芽菜（以下簡稱芽菜）目前采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵法生產(chǎn)，即將芽菜存放在發(fā)酵池或者陶瓷壇中自然發(fā)酵，發(fā)酵周期一般為4～6 個月。目前，芽菜的發(fā)酵生產(chǎn)周期長且質(zhì)量不穩(wěn)定，成為大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。為此，通過菌種選育，從芽菜中篩選出優(yōu)勢菌株，接種于芽菜進行發(fā)酵，在保證芽菜質(zhì)量的同時縮短發(fā)酵時間成為目前芽菜研究面臨的主要問題。在芽菜發(fā)酵過程中，由于微生物新陳代謝作用，形成了芽菜的獨特風味，其主要成分為芽菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的有機酸，這些有機酸與其他物質(zhì)相互作用，形成了芽菜怡人的風味。因此，研究芽菜品質(zhì)，可通過有機酸的變化，間接反映出芽菜發(fā)酵效果的好壞。目前，有機酸的分析方法主要有酸堿滴定法（劉珍，2004）、薄層色譜法（石尚友 等，2005；馮雅斌 等，2011）、氣相色譜法（朱曉蘭 等，2004；于世林，2010）及高效液相色譜法（丁明玉 等，1997；鄧叢蕊，1997；金高娃 等，2006；龐新安和萬英，2007；李銀科 等，2011）等。酸堿滴定法只能測定總酸量，不能具體反映出有機酸的種類及其含量，而且操作繁瑣；薄層色譜法雖可測定多種有機酸，但測量精度差，不適合定量分析；氣相色譜法需衍生步驟，誤差較大；而高效液相色譜法操作簡便、準確度高、重現(xiàn)性好，可同時定量多種有機酸，因此獲得廣泛的應用（賈洪鋒 等，2008；Zhang et al.，2008；周曉明 等，2011）。芽菜有機酸含量是影響芽菜品質(zhì)的一種滋味物質(zhì)，也是區(qū)別人工接種和自然發(fā)酵的標準之一（朱薇 等，2006；周相玲 等，2011）。

本試驗通過對人工接種發(fā)酵和自然發(fā)酵芽菜產(chǎn)品的有機酸種類及含量進行對比分析，結(jié)合芽菜感官評定和理化指標測定結(jié)果，對芽菜發(fā)酵菌種進行優(yōu)選，對保證芽菜品質(zhì)、縮短芽菜發(fā)酵周期具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品1：自然發(fā)酵的芽菜產(chǎn)品；樣品2：接種AN∶AE 復合菌種發(fā)酵的芽菜產(chǎn)品；樣品3：接種AN1∶AE 復合菌種發(fā)酵的芽菜產(chǎn)品。以上菌種均由四川理工學院微生物實驗室從宜賓雙誼富康芽菜中篩選得到，AN 為枯草芽孢桿菌亞種，AE 為橙黃紅酵母菌B，AN1為枯草芽孢桿菌亞種誘變菌株。樣品2 和樣品3 的接種比例相同，3 個樣品均在相同的條件下發(fā)酵，均在發(fā)酵第2個月時從芽菜壇的中部取樣。

1.2 儀器與試劑

試驗儀器：Agilent1200 高效液相色譜儀，配 Empower 色譜工作站（美國安捷倫公司）；RE-52CS-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1104 電子天平〔梅特勒-托多儀器（上海）有限公司〕；賽默飛世爾移液器〔賽默飛世爾（上海）儀器有限公司〕；TDL-5C 型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

試驗試劑：酒石酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、草酸，分析純（成都市科龍化工試劑廠）；乙酸，分析純（成都金山化學試劑有限公司）；磷酸氫二銨，色譜純（成都市科龍化工試劑廠）；甲醇、磷酸，色譜純（美國天地有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 芽菜的感官評定和理化指標測定 將活化的菌種AN、AN1分別和AE 按5%體積比接種到芽菜中，其他工藝同自然發(fā)酵法，發(fā)酵2 個月后對其進行感官評定（吳謀成，2002）和理化指標測定，3 次重復，取平均值。

感官評定小組由10 人組成。為了減少從測定到形成概念之間的許多因素（如嗜好和偏愛）對檢驗結(jié)果的影響，采用雙盲法進行檢驗，對樣品進行密碼編號（采用3 位隨機數(shù)字），檢驗樣品隨機化。評定時由感官評定成員單獨進行，相互不接觸交流，每個樣品評定前用清水漱口（吳謀成，2002）。

芽菜中的水分、還原糖、NaCl、氨基態(tài)氮含量及pH 值測定參照SB/T 10213；亞硝酸鹽含量測定參照GB 5009.33。

1.3.2 芽菜的有機酸測定

1.3.2.1 樣品前處理 準確稱取芽菜樣品1、樣品2、樣品3 各20 g，剪碎，加入超純水50 mL，75 ℃水浴中分別提取30 min，冷卻后補足水分，過濾后取濾液，離心（8 000 r·min-1）20 min，取上清液5.0 mL，待用。

1.3.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測器：VWD，檢測波長為210 nm，色譜柱流速0.8 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流動相：磷酸鹽緩沖溶液（pH=2.3）∶甲醇（95V∶5V）。

1.3.2.3 定量定性分析 標準溶液的配制：分別將草酸、酒石酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸配制成有機酸標樣系列溶液及有機酸混合標準品溶液，有機酸混合標準品溶液中草酸濃度為20 μg·mL-1，其余有機酸濃度均為100 μg·mL-1。按照確定的色譜優(yōu)化條件分別進樣分析，繪制標準曲線，得出線性方程。

有機酸定性定量分析方法：有機酸的定性方法是在1.3.2.2 的色譜條件下進樣各有機酸的單標溶液，確定各有機酸的保留時間，然后再進樣有機酸混合標準品溶液，得到有機酸混合標準溶液的色譜圖，根據(jù)單標有機酸的保留時間來區(qū)別混合標準品溶液中有機酸的種類，最后結(jié)合添加標樣量的方法來確定。樣品中有機酸的定性方法與有機酸混合標準品溶液的定性方法類似。

有機酸的定量方法采用標準溶液的峰面積外標法來測量，通過制作8 種有機酸的標準曲線，對樣品中有機酸進行定量分析。

回收率：采用加樣回收率測定法，取已處理好的的樣品3 樣液10 mL 于100 mL 容量瓶中，分別加入定量乳酸、草酸、乙酸及琥珀酸等8 種有機酸標準液，定容。按1.3.2.2 色譜條件分別測定其含量，3 次重復，計算其回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽菜的感官評定和理化指標測定結(jié)果

感官評定是檢測芽菜質(zhì)量的一個重要指標。以樣品1 為標準，對其他樣品進行評分。其中，色澤、香味、甜味、嫩、柔軟5 方面若優(yōu)于樣品1，則根據(jù)不同感官加分，反之則減分；若刺激味、酸味、咸味、苦味、澀味比樣品1 強則相應減分，反之加分。由表1 可知，樣品1 總分為0，樣品2 總分為3 分，樣品3 總分為8 分，即樣品3 的感官效果最佳。

表1 宜賓芽菜的感官評定結(jié)果

測定理化指標是檢驗芽菜質(zhì)量的另一個重要檢測手段（陳斌和黃星奕，2004）。本試驗在國家腌菜質(zhì)量標準的基礎上，對涉及到芽菜的質(zhì)量、品質(zhì)及風味的各項理化指標進行了測定。結(jié)果表明（表2），人工接種發(fā)酵的芽菜樣品（樣品2、樣品3）和自然發(fā)酵的芽菜樣品（樣品1）的理化指標基本吻合。

表2 宜賓芽菜的理化指標測定結(jié)果

2.2 芽菜的有機酸測定結(jié)果

2.2.1 回歸方程和圖譜 標準品稀釋適當倍數(shù)，用0.45 μm 的微孔濾膜過濾后進樣10 μL，按優(yōu)化后的色譜條件對混合有機酸標準溶液進樣分析，在15 min 內(nèi)實現(xiàn)了8 種有機酸基線的分離，得到了有機酸標準品色譜圖（圖1）。以質(zhì)量濃度x（mg·mL-1）對峰面積y（mAU）求得不同濃度的乙酸、草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、L-蘋果酸和D-蘋果酸的面積標準曲線及線性相關系數(shù)（表3）。

圖1 有機酸標準HPLC 圖

由圖1 和表3 可知，蘋果酸會出現(xiàn)2 次保留時間，是因為蘋果酸分為D-蘋果酸（5.827 min）和L-蘋果酸（10.280 min），它們出現(xiàn)的峰保留時間不同。

2.2.2 回收率 從表4 可以看出，各種有機酸的平均回收率在93.10%～98.46%之間，說明該試驗方法測定的結(jié)果可靠。

2.2.3 樣品有機酸的測定結(jié)果 將樣品按有機酸定性定量分析的方法進行處理，在已確定色譜條件下進樣分析。在相同條件下每個樣品平行進樣2 次，每次進樣10 μL，記錄結(jié)果，其色譜圖分別如圖2、3、4所示。

表3 各種有機酸的線性回歸方程及相關系數(shù)

表4 各種有機酸的回收率

通過比較圖2、3、4 可以看出，人工接種的樣品2 和樣品3 峰的數(shù)量、峰面積大小都明顯多于未接種的樣品1，其中樣品3 比樣品2 的峰面積大，這可能是由于人工接種打亂了芽菜自然發(fā)酵的微生物體系，使乳酸菌和酵母菌在短時間內(nèi)得到大量繁殖，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，使芽菜的發(fā)酵周期變短，風味物質(zhì)增多；而樣品1（自然發(fā)酵）的一般發(fā)酵周期長達4～6 個月，在短期內(nèi)（2 個月）還沒有發(fā)酵成熟，所以有機酸峰的數(shù)量、峰面積都明顯少于人工接種的芽菜樣品。樣品2 和樣品3 相比較，樣品3 的有機酸的種類及含量較多，表明誘變的菌種在芽菜發(fā)酵中效果比未誘變的菌種好。

將各樣品色譜圖與有機酸標準色譜圖進行對比，用外標法確定不同樣品芽菜中有機酸的含量，結(jié)果見表5。

由表5 可知，樣品1 中的有機酸主要為草酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、L-蘋果酸；樣品2 和樣品3 中的有機酸主要為草酸、酒石酸、D-蘋果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸。3 個樣品中的有機酸種類及含量有明顯差異，造成這種差異的原因可能是由于人工接種改變芽菜發(fā)酵的微生物區(qū)系而使代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。樣品3 的有機酸含量最高，其中乳酸（18.930 mg·g-1）和乙酸（1.704 0 mg·g-1）的含量比樣品1 和樣品2 高很多，表明通過誘變的菌種產(chǎn)酸能力增強，誘變達到了理想效果。

圖2 樣品1 的有機酸HPLC圖

圖3 樣品2 的有機酸HPLC圖

圖4 樣品3 的有機酸HPLC圖

表5 樣品中有機酸的種類及含量 mg·g-1

3 結(jié)論

反相高效液相色譜法能夠快速、準確地分析不同樣品芽菜風味物質(zhì)的差異。在相同的環(huán)境條件下，人工接種發(fā)酵的芽菜樣品的風味物質(zhì)種類及含量明顯高于自然發(fā)酵的芽菜樣品。

通過檢測不同菌種發(fā)酵樣品中的有機酸種類及含量，結(jié)合感官評定和理化指標測定結(jié)果表明，AN1∶AE 復合菌種為最優(yōu)菌種，其發(fā)酵產(chǎn)品（樣品3）總酸含量最高，達到35.97 mg·g-1。

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