中國(guó)馬鈴薯主要育成品種抗病毒分子標(biāo)記分析

趙興濤 徐建飛 龐萬福 卞春松 段紹光 劉 杰 段艷鳳 金黎平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）栽培面積廣泛，是世界上僅次于水稻和小麥的第三大糧食作物。中國(guó)是馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó)，全國(guó)各地均有栽培（金黎平和屈冬玉，2002）。病毒病是為害馬鈴薯的重要病害，是造成馬鈴薯種薯退化的重要因素，每年世界上由于馬鈴薯病毒病造成的減產(chǎn)至少為20%（王曉明 等，2005）。

在引起馬鈴薯病毒病的病毒中，PVY（potato virus Y）和PVX（potato virus X）是危害較為嚴(yán)重的兩種病毒。Ryadg是控制馬鈴薯對(duì)PVY 具有極端抗性（extreme resistance，ER）的基因，來源于安第斯栽培種（Solanum tuberosumssp.Andigena），1996年被定位在第11 號(hào)染色體的末端（H?m?l?inen et al.，1997），Kasai 等（2000）設(shè)計(jì)了與該基因緊密連鎖的分子標(biāo)記RYSC3，目前該標(biāo)記已開始應(yīng)用于國(guó)外的育種進(jìn)程（Ottoman et al.，2009）。Rx基因控制馬鈴薯對(duì)PVX 的極端抗性，Rx1（Rxadg）來源于安第斯栽培種，Rx2（Rxacl）來源于野生種無莖薯（Solanum acaule），1991年被分別定位在第12 號(hào)和5 號(hào)染色體（Ritter et al.，1991），這兩個(gè)基因的克隆分離分別于1999年和2000年完成（Bendahmane et al.，1999，2000），Ohbayashi 等（2010）根據(jù)Rx1基因的序列設(shè)計(jì)了STS 標(biāo)記Rxsp，研究結(jié)果顯示該標(biāo)記與基因的重組率僅為1.3%（Mori et al.，2011）。

本試驗(yàn)利用與抗PVY 和PVX 基因Ryadg和Rx緊密連鎖的分子標(biāo)記RYSC3 及Rxsp，對(duì)我國(guó)190 份馬鈴薯主要育成品種進(jìn)行了檢測(cè)分析，以期為馬鈴薯抗病毒育種、優(yōu)良基因聚合及分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯主要育成品種190 份（表2），由全國(guó)18 個(gè)省、市22 個(gè)單位提供。于2008年種植于河北張家口壩上試驗(yàn)基地，每品種10 株，株距0.3 m，行距0.6 m，常規(guī)田間管理。

1.2 DNA提取

取苗期植株幼嫩、健壯新鮮的葉片，采用CTAB 法結(jié)合高通量的Retsch 細(xì)胞破碎儀（Retsch Inc.，Haan，Germany）快速提取植物基因組DNA（Jones ＆ Walker，1963），1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度和質(zhì)量后，樣品稀釋至10 ng·μL-1，置-20 ℃冰箱保存。

1.3 分子標(biāo)記分析

標(biāo)記信息見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 標(biāo)記信息

RYSC3 標(biāo)記PCR 擴(kuò)增體系10 μL，其中10 ng·μL-1模板DNA 2.0 μL，10×TaqBuffer 1.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 0.8 μL，5 μmol·L-1上游引物0.25 μL，5 μmol·L-1下游引物0.25 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.2 μL，ddH2O 5.5 μL；Rxsp 標(biāo)記PCR 擴(kuò)增體系10 μL，其中10 ng·μL-1模板 DNA 2.0 μL，10×TaqBuffer 2.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture1.0 μL，5 μmol·L-1上游引物1.0 μL，5 μmol·L-1下游引物1.0 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 2.9 μL。試劑均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

36 個(gè)循環(huán)PCR 反應(yīng)程序：94 ℃變性30 s，Tm 退火30 s，72 ℃延伸1 min。第1 個(gè)循環(huán)之前94 ℃預(yù)變性10 min。最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)在Veriti PCR 儀（Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行。PCR 產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠、電壓8 V·cm-1條件下電泳40 min，溴化乙錠（EB）著色后經(jīng)直觀成像系統(tǒng)Chemi-Smart 3100（Vilber Lourmat 公司）成像（圖1）。

圖1 RYSC3 與Rxsp 標(biāo)記在部分馬鈴薯品種中的擴(kuò)增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 我國(guó)馬鈴薯主要育成品種抗病毒標(biāo)記分析

對(duì)190 份供試馬鈴薯品種進(jìn)行RYSC3 和Rxsp 標(biāo)記分析，160 份品種既不含RYSC3 標(biāo)記，也不含Rxsp 標(biāo)記，占到了供試品種的84.2%；只含有RYSC3 標(biāo)記的品種15 份，占供試品種的7.9%；只含有Rxsp 標(biāo)記的品種8 份，占供試品種的4.2%；既含RYSC3 標(biāo)記也含Rxsp 標(biāo)記的品種7 份，占供試品種的3.7%（表2）。

表2 我國(guó)馬鈴薯主要育成品種RYSC3 和Rxsp 標(biāo)記分析結(jié)果

2.2 我國(guó)馬鈴薯抗病毒品種育成親本來源分析

在含有 RYSC3 標(biāo)記的品種中，國(guó)際馬鈴薯中心（CIP）引進(jìn)的資源材料所育成的品種占31.8%，新型栽培種所育成的品種占9.1%（表3）；在含有Rxsp 標(biāo)記的品種中，國(guó)際馬鈴薯中心引進(jìn)的資源材料所育成的品種占26.7%，新型栽培種所育成的品種占20.0%。

表3 我國(guó)馬鈴薯抗病毒品種育成親本來源分析結(jié)果

2.3 我國(guó)馬鈴薯抗病毒品種育成年份分析

在含有RYSC3 標(biāo)記的馬鈴薯品種中，2001年之前審定的品種9 份，2001年之后審定的品種11 份，分別占供試品種的40.9%與50.0%（表4）。在含有Rxsp 標(biāo)記的品種中，2001年之前審定的品種3 份，2001年之后審定的品種12 份，分別占供試品種的20.0%與80.0%。

表4 我國(guó)馬鈴薯抗病毒品種育成年份分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

20 世紀(jì)30年代至今，國(guó)際上將馬鈴薯野生種作為優(yōu)良抗性基因的來源廣泛應(yīng)用于抗性育種進(jìn)程。而在我國(guó)，特別是20 世紀(jì)90年代以前，育種親本單一，遺傳多樣性差的問題比較突出。2000年以來，我國(guó)馬鈴薯育種發(fā)展迅速，育成的品種數(shù)量迅速增加，遺傳基礎(chǔ)狹窄的情況有所改善，但是審定品種親緣關(guān)系近，遺傳多樣性仍較差（徐敏 等，2007），許多控制優(yōu)良性狀的基因不能引入到育種中。

本試驗(yàn)利用與Ryadg和Rx基因連鎖的兩個(gè)標(biāo)記RYSC3 和Rxsp，對(duì)190 份我國(guó)主要育成的馬鈴薯品種進(jìn)行了檢測(cè)分析，揭示了兩個(gè)抗病毒基因在我國(guó)馬鈴薯品種中的分布情況。雖然所用標(biāo)記較少，不足以完全代表我國(guó)馬鈴薯品種的抗病毒基因攜帶情況，但結(jié)果可以反映出以下問題和情況：①我國(guó)審定品種中含有優(yōu)良抗病毒基因的比例較?。虎谠诤锌共《緲?biāo)記的品種中，由新型栽培種資源或從CIP 引進(jìn)的資源育成的品種占了40%以上，這表明利用這兩種類型的材料，有助于提高材料抗病毒基因的多態(tài)性；③2001年以來，育成的含有抗病毒標(biāo)記的品種數(shù)量明顯增加，說明我國(guó)馬鈴薯抗病毒育種取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。

目前，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于馬鈴薯遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的基因定位克隆以及馬鈴薯種質(zhì)資源的研究。這些為馬鈴薯的分子標(biāo)記輔助育種打下了良好的基礎(chǔ)，也為提高我國(guó)馬鈴薯綜合育種水平和加快育種進(jìn)程提供了良好的機(jī)遇。然而，由于缺乏足夠多的與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記使得實(shí)際用于育種實(shí)踐的標(biāo)記較少（Carrasco et al.，2009），因此開發(fā)更多的與重要性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記并應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇進(jìn)程，是一項(xiàng)緊迫和重要的工作。

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