辣椒不同外植體處理方法對組織培養再生的影響

曹亞從 張正海 王立浩 毛勝利 張寶璽

（農業部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，中國農業科學蔬菜花卉研究所，北京 100081）

辣椒（Capsicum annuumL．）屬于茄科（Solanaceae），是一種重要的蔬菜作物，與番茄、馬鈴薯等其他茄科蔬菜作物相比，其組織培養的再生率很低（Liu et al.，1990），屬于頑拗型再生植物。辣椒不同基因型的外植體，其內源激素水平有很大差異，而且不同組織器官內源激素分布有差異（李浚明，2002），所以不同基因型、不同組織器官很難建立一個通用的組織培養再生體系。辣椒再生困難主要表現為芽誘導率以及伸長率低。在辣椒芽誘導培養中，通常在培養基中添加植物生長物質，以提高芽誘導率，使用較多的是IAA 和6-BA 組合（Agrawal et al.，1989；Sanatombi ＆ Sharma，2008），以及TDZ（Manoharan et al.，1998；Dabauza ＆ Pena，2001；Ahmad et al.，2006）、ZT（Binzel et al.，1996）等，也有報道稱通過調整培養基中的有機成分可以促進芽的分化（Hyde ＆ Phillips，1996；Husain et al.，1999；羅齊軍，2005），無機物AgNO3也常被用來促進芽的分化（Hyde ＆ Phillips，1996）。細胞分裂素能促進細胞的分裂，對于伸長有一定的抑制作用，在辣椒再生培養的伸長培養基中通常降低細胞分裂素的含量，并加入GA3來促進再生芽的伸長（Berljak，1999；Steinitz et al.，1999；Arouset al.，2001；Joshi ＆ Kothari，2007）。

外植體的類型對于辣椒的組織培養再生有很大影響，Valadez-Bustos 等（2009）的研究表明，以子葉為外植體時，再生芽難以形成正常植株，多為叢生的畸形芽或葉狀體，而以下胚軸為外植體誘導出的芽容易生成再生植株。張宗江等（1994）研究認為由子葉誘導出的葉狀體實際上是外植體組織的延伸，所以并不能形成正常的芽。筆者曾以本試驗中的5 個品系為試材，以子葉作為外植體進行辣椒的組培再生，發現了相似的現象，只得到了較少的再生植株（待發表）。

組織培養再生是遺傳轉化的必要前提，本試驗以5 個基因型的辣椒為試材，采用不同處理方法的外植體，在添加或不添加植物生長物質的MS 培養基上進行再生培養，以期建立良好的再生體系，旨在為辣椒的遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 3 個甜椒自交系（0510、0516、77013）和2 個辣椒自交系（0818、0819）均由中國農業科學院蔬菜花卉研究所辣椒課題組選育。

1.1.2 培養基成分 M0，MS+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M1，MS + IAA（0.2、0.4 mg·L-1）+ 6-BA（4.0、5.0、6.0 mg·L-1）+ 蔗糖30.0 g·L-1+ 瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M2，MS + IAA（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1）+ 6-BA（4.0、5.0、6.0 mg·L-1）+ AgNO3（0、5.0、10.0 mg·L-1）+ 蔗糖30.0 g·L-1+ 瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M3，MS + ZT 或TZT（2.0 mg·L-1）+蔗糖30.0 g·L-1+ 瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）。

1.2 無菌苗的獲得

種子在75%酒精中浸泡處理1 min，再用有效氯9%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，然后用無菌水以流水的方式沖洗20 s，獲得無菌種子。將無菌種子播于M0和M1培養基，置于27 ℃、每天光照16 h 的培養箱中培養，獲得無菌苗。

1.3 不同處理方法外植體的再生

1.3.1 下胚軸切段的再生 采用M0培養基上生長的無菌苗，當無菌苗的下胚軸剛伸直時（播種后10～12 d），切去子葉、生長點和根，將下胚軸截為1 cm 左右的小段作為外植體，置于M0和M2培養基（Agrawal et al.，1989；Arroyo ＆ Revilla，1991；Christopher ＆ Rajam，1996；Sanatombi ＆ Sharma，2008），20 d 更換一次培養基。

1.3.2 直接斬首后下胚軸的再生 采用M0和M1培養基上生長的無菌苗，分3 個時段進行處理，分別是：無菌苗還未脫掉種皮時（播種后約7 d），緊挨萌發孔處切去子葉及生長點；無菌苗長至彎鉤狀時（播種后約9 d），從彎鉤處剪去子葉及生長點；無菌苗的下胚軸剛伸直時（播種后10～12 d），從子葉下方約5 mm 處剪去子葉和生長點。去除子葉和生長點的帶根下胚軸繼續置于原培養基中培養，20 d 更換一次培養基。

1.3.3 針刺斬首后下胚軸的再生 采用M0培養基上生長的無菌苗，分2 個時段進行處理，分別是：當無菌苗長至彎鉤狀時，用無菌針刺破下胚軸彎鉤處，繼續在原培養基上培養12 d 后，從子葉以下1～2 mm 處剪去子葉及生長點（Ramirez-Malagón ＆ Ochoa-Alejo，1996）；當無菌苗的下胚軸剛伸直時，從子葉下方約5 mm 處刺破下胚軸，繼續在原培養基上培養12 d 后，從子葉以下1～2 mm 處剪去子葉及生長點。20 d 更換一次培養基。

1.3.4 半粒種子的再生 處理方法參照Ezura等（1993）的方法，將無菌濾紙放于已滅菌的培養皿中，用無菌水將濾紙浸潤后，將無菌種子置于濾紙上預培養3 d，培養條件同無菌苗的培養。預培養3 d 的無菌種子從萌發孔處橫切為兩部分（圖1），將帶有子葉、胚芽和部分下胚軸的半粒種子（圖1 中B 部分）置于M0培養基，將帶有部分下胚軸及胚根的半粒種子（圖1 中A 部分）置于M0和M3培養基（Binzel et al.1996），20 d 更換一次培養基。

圖1 種子切割示意圖（用于半粒種子培養）

1.4 數據統計與分析

外植體培養90 d 后，對外植體數、出芽外植體數進行統計。

2 結果與分析

2.1 不同處理方法外植體對辣椒組織培養再生的影響

不同處理方法外植體對辣椒的組織培養再生有明顯的影響，表2 中比較了幾種處理方法外植體再生率的差異。在添加植物生長物質的培養基中外植體未誘導形成再生芽（表1），此處僅討論未添加植物生長物質培養基中外植體的再生情況。

表1 不同處理方法、不同基因型的外植體再生狀況

5 份材料的下胚軸切段均能形成愈傷組織（圖2-a），但均未誘導出再生芽。

當無菌苗還未露出子葉、長至彎鉤狀或下胚軸剛伸直時切去子葉及生長點，在傷口處會形成大量愈傷組織。90 d 后統計再生狀況，只有0516 還未露出子葉時直接斬首后的帶根下胚軸（圖2-b），以及0819 長至彎鉤狀態時直接斬首后的帶根下胚軸（圖2-c）各長出一個伸長的再生芽。

針刺下胚軸的傷口處會形成白色愈傷組織，剪去子葉及生長點7～10 d 后，部分針刺傷口處會分化出葉片，約30 d 后有明顯伸長的再生芽形成（圖2-d），斬首的傷口處不分化形成葉片及再生芽。90 d 后統計再生狀況，0510 下胚軸剛伸直時針刺后斬首的帶根下胚軸，以及0516下胚軸彎鉤狀時針刺后斬首的帶根下胚軸未形成再生植株。

帶有子葉、胚芽以及部分下胚軸的半粒種子會在傷口處形成根（圖2-e）；帶有胚根及部分下胚軸的半粒種子播于MS 固體培養基上后，長出正常的根，有的外植體傷口處只形成大量白色愈傷組織（圖2-f），有的外植體傷口處形成少量白色愈傷組織，也有外植體在傷口處形成綠色不定芽，并形成葉片（圖2-g），大約播種30 d 后，部分外植體有再生芽出現（圖2-h）。外植體形成明顯再生芽的誘導時間存在差異，播種后30～90 d 期間均有伸長的再生芽形成。大部分外植體只形成一個伸長的再生芽，只有極少數形成兩個以上伸長的再生芽（圖2-i）。

不同處理方法的外植體，形成再生芽的時間也存在差異。當以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子作為外植體時，從播種開始大約30 d 有再生芽形成；直接斬首后的外植體，從播種開始約40 d 有再生芽形成；針刺后斬首的外植體，從播種開始大約45 d 有再生芽形成。

以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子作為外植體時，再生率最高，而且再生速度快，再生芽能正常伸長，在本試驗中此種處理方法的外植體最有利于辣椒的組培再生。

圖2 不同處理方法外植體對辣椒組織培養再生的影響

2.2 植物生長物質對辣椒幼苗及外植體組織培養再生的影響

在不添加植物生長物質的培養基中，辣椒幼苗及外植體的根部生長狀態正常（圖3-a），在添加植物生長物質的培養基中生長的幼苗及外植體根部變粗，生長狀態異常（圖3-b）。

圖3 植物生長物質對辣椒根部生長的影響

在添加植物生長物質的培養基中生長的下胚軸切段、直接斬首后帶有根的下胚軸和半粒種子均未誘導出再生芽（表1）。

2.3 基因型對辣椒組織培養再生的影響

本試驗中，不同基因型的辣椒再生率存在差異（表2）。在不添加植物生長物質的培養基中，2 個辣椒品系的平均再生率（9.00%）明顯高于3 個甜椒品系的平均再生率（0.77%）。

表2 不同處理方法、不同基因型的外植體在未添加植物生長物質的培養基上的再生率 %

辣椒品系、甜椒品系內部再生率也存在差異。甜椒品系0516 的平均再生率（1.07%）明顯高于0510（0.42%）和77013（0.82%），辣椒品系0818 的平均再生率（9.85%）明顯高于0819（8.16%）。

2.4 AgNO3對外植體的影響

在下胚軸切段進行再生的過程中，添加 AgNO3的培養基中外植體的顏色較深，在不添加AgNO3的培養基中外植體的顏色較淺，而且呈現出玻璃化的狀態。添加AgNO3可能對減少外植體的玻璃化狀態有一定的作用，但對于外植體的再生并無明顯的促進作用。

3 結論與討論

根部和幼嫩葉片能夠合成生長素和細胞分裂素（武維華，2008），Ramirez-Malagón 和Ochoa-Alejo（1996）以及Pozueta-Romero等（2001）認為子葉在生長過程中形成的植物激素對于形成伸長的再生芽有重要作用，切除子葉和生長點后，只帶有胚根和下胚軸的外植體并不能形成伸長的再生芽。然而，與其結果不同的是，在本試驗中帶有胚根和部分下胚軸的外植體能夠在不添加植物生長物質的培養基中形成再生芽，此結果說明根在再生芽形成過程中有重要作用，可能是根部合成的生長素和細胞分裂素促進了下胚軸的再生。針刺后斬首的帶根下胚軸（下胚軸形成傷口后一段時期內仍保留子葉，并有真葉形成）的再生率高于直接斬首的帶根下胚軸（下胚軸形成傷口后不保留子葉），說明葉片對再生芽的形成有促進作用，可能是葉片合成的激素在一定程度上促進了再生芽的分化。

在辣椒的組織培養再生中，常使用生長素（IAA）和細胞分裂素類（6-BA、TDZ、ZT）這兩類植物生長物質來促進再生芽的分化（Agrawal et al.，1989；Binzel et al.，1996；Ahmad et al.，2006）。然而，在本試驗中不帶子葉、胚芽及胚根的下胚軸切段，即使在添加了生長素和細胞分裂素的培養基中，也未分化出再生芽。可能原因是本試驗中采用的植物生長物質濃度、配比沒有滿足所采用外植體再生的需求。

基因型對辣椒的離體再生有很大影響，這也是對辣椒再生研究最多的一個影響因素。對于特定的培養方法，選擇合適的基因型是建立高效、穩定再生體系的前提。本試驗中采用的2 個辣椒品系（0818、0819）的再生率遠遠高于3 個甜椒品系（0510、0516、77013），這與前人的報道相吻合（陳靜嫻和聶凡，1990；Dabauza & Pena，2001；羅齊軍和曾富華，2007），辣椒品系比甜椒品系易形成再生植株。

辣椒的組培再生芽可以由外植體傷口處直接誘導形成，也可以由傷口處形成的愈傷組織再分化形成，但是在辣椒的組培再生中，由愈傷組織再分化出芽的比率很低（沈火林 等，1993），再生芽往往是由傷口處直接形成（別之龍和劉佩英，1996）。本試驗也發現類似的現象，再生芽往往在傷口邊緣的表皮處形成，當傷口處形成大量白色愈傷組織，并將傷口覆蓋后，往往不能形成再生芽。將帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子形成的白色愈傷組織剝除后，可以看到在傷口周圍有一些很小的綠色芽點，可能是大量的白色愈傷組織阻礙了這些綠色芽點的繼續發育；然而，針刺后斬首的帶根下胚軸，在其針刺傷口處，可形成大量白色愈傷組織，再生芽與大量白色愈傷組織同時存在，但是，再生芽往往在傷口邊緣形成，并不是由愈傷組織再分化形成，這些現象表明，不經愈傷組織或胚狀體結構而形成的再生芽，可能與亞麻下胚軸再生培養中觀察結果相似（李浚明，2002），再生芽可能是由下胚軸的表皮細胞形成。

辣椒的組培再生研究中，可以利用的外植體類型很多，Ebida 和Hu（1993）研究發現，子葉、莖尖和下胚軸均能形成再生植株，子葉的再生能力最強。但是由于基因型、培養基等因素的互作，不同研究中會出現相異的結果。本試驗中，當以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子為外植體，2 個辣椒品系有良好的再生效果，而且再生芽通常能伸長，形成正常再生植株，但在此方法操作過程中要注意剔除假再生植株，再生芽通常由表皮細胞處形成，由下胚軸橫切面中心部位形成的芽通常是由原生長點形成，不是再生芽，需要剔除。

組織培養再生過程中，培養基的成分對于誘導形成再生植株有重要影響，在辣椒的組培再生中，通常采用MS 培養基，Szász 等（1995）、Ebida 和Hu（1993）、Arroy 和Revilla（1991）均以MS 培養基為基本培養基，進行辣椒的組織培養再生，誘導出了完整的再生植株，但是在培養基中添加了不同的植物生長物質。而在本試驗中，在不添加植物生長物質的MS 培養基中，以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子為外植體，獲得到了良好的再生效果，避免了因添加植物生長物質而造成植株變異的情況。而且這種方法不需要進行再生根的誘導，在一定程度上提高了再生率。

以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子為外植體，再生率較高，無植物生長物質的不良影響，操作比較方便，可以嘗試用于辣椒的遺傳轉化研究。

別之龍，劉佩瑛．1996．辣椒的離體培養與遺傳轉化．長江蔬菜，（8）：1-5．

陳靜嫻，聶凡．1990．辣椒子葉培養及其植株再生的研究．安徽農業科學，（3）：255-257．

李浚明．2002．植物組織培養教程．2 版．北京：中國農業大學出版社：51-52，54-55．

羅齊軍．2005．Rs-AFP2基因植物表達載體的構建及其轉化辣椒的研究〔碩士論文〕．長沙：湖南農業大學．

羅齊軍，曾富華．2007．辣椒抗病基因工程研究進展．亞熱帶植物科學，36（4）：67-71．

沈火林，王志源，蔣健箴，任華中，王德恒．1993．辣椒的組織培養與植株再生．北京農業大學學報，19（2）：73．

武維華．2008．植物生理學．2 版．北京：科學出版社：271-307．

張宗江，周鐘信，劉艷軍，江倩云，尤明，劉國民，米景九．1994．黃瓜花葉病毒殼蛋白基因轉化辣椒及其在轉基因株后代的表達．華北農學報，9（3）：67-71．

Agrawal S，Chandra N，Kothari S．1989．Plant regeneration in tissue cultures of pepper（Capsicum annuumL.cv.Mathania）．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，16（1）：47-55．

Ahmad N，Siddique I，Anis M．2006．Improved plant regeneration inCapsicum annuumL.from nodal segments．Biologia Plantarum，50（4）：701-704．

Arous S，Boussaid M，Marrakchi M．2001．Plant regeneration from zygotic embryo hypocotyls of Tunisian chili（Capsicum annuumL.）．J Appl Hort，3（1）：17-22．

Arroyo R，Revilla M．1991．In vitroplant regeneration from cotyledon and hypocotyl segments in two bell pepper cultivars．Plant Cell Reports，10（8）：414-416．

Berljak J．1999．In vitroplant regeneration from pepper（Capsicum annuumL.cv.‘Soroksari’） seedling explants．Phyton，39（3）：289-292．

Binzel M，Sankhla N，Joshi S，Sankhla D．1996．In vitroregeneration in chile pepper（Capsicum annuumL．）from‘half-seed explants’．Plant Growth Regulation，20（3）：287-293．

Christopher T，Rajam M．1996．Effect of genotype，explant and medium onin vitroregeneration of red pepper．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，46（3）：245-250．

Dabauza M，Pena L．2001．High efficiency organogenesis in sweet pepper（Capsicum annuumL．）tissues from different seedling explants．Plant Growth Regulation，33（3）：221-229．

Ezura H，Nishimiya S，Kasumi M．1993．Efficient regeneration of plants independent of exogeneous growth regulators in bell pepper（Capsicum annuumL．）．Plant Cell Reports，12（12）：676-680．

Ebida A，Hu C．1993．In vitromorphogenetic responses and plant regeneration from pepper（Capsicum annuumL.cv.Early California Wonder）seedling explants．Plant Cell Reports，13（2）：107-110．

Husain S，Jain A，Kothari S．1999．Phenylacetic acid improves bud elongation andin vitroplant regeneration efficiency inCapsicum annuumL.Plant Cell Reports，19（1）：64-68．

Hyde C L，Phillips G C．1996．Silver nitrate promotes shoot development and plant regeneration of chile pepper（Capsicum annuumL．）via organogesis．In VitroCellular and Developmental Biology-Plant，32（2）：72-80．

Joshi A，Kothari S．2007．High copper levels in the medium improves shoot bud differentiation and elongation from the cultured cotyledons ofCapsicum annuumL．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，88（2）：127-133．

Liu W，Parrott W，Hildebrand D，Collins G，Williams E．1990．Agrobacterium induced gall formation in bell pepper（Capsicum annuumL．）and formation of shoot-like structures expressing introduced genes．Plant Cell Reports，9（7）：360-364．

Manoharan M，Sree Vidya C S，Lakshmi Sita G．1998．Agrobacterium-mediated genetic transformation in hot chilli（Capsicum annuumL.var.Pusa jwala）．Plant Science，131（1）：77-83．

Pozueta-Romero J，Houlne G，Canas L，Schantz R，Chamarro J．2001．Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explants for Agrobacetrium-mediated transformation．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，67（2）：173-180．

Ramirez-Malagón R，Ochoa-Alejo N．1996．An improved and reliable chili pepper（Capsicum annuumL．）plant regeneration method．Plant Cell Reports，16（3）：226-231．

Sanatombi K，Sharma G．2008．In vitroplant regeneration in six cultivars ofCapsicumspp．using different explants．Biologia Plantarum，52（1）：141-145．

Steinitz B，Wolf D，Matzevitch-Josef T，Zelcer A．1999．Regenerationin vitroand genetic transformation of pepper（Capsicumspp．）：the current state of the art．Capsicum and Eggplant Newsletter，18：9-15．

Szász A，Nervo G，Fári M．1995．Screening forin vitroshoot-forming capacity of seedling explants in bell pepper（Capsicum annuumL.）genotypes and efficient plant regeneration using thidiazuron．Plant Cell Reports，14（10）：666-669．

Valadez-Bustos M G，Aguado-Santacruz G A，Camillo-Castaeda G，Aguilar-Rincón V H，Espitia-Rangel E，Montes-Hernández S，Robledo-Paz A．2009．In vitropropagation and agronomic performance of regenerated chili pepper（Capsicumspp．）plants from commercially important genotypes．In VitroCellular and Developmental Biology-Plant，45（6）：650-658．