超聲波浸提黑木耳菌糠纖維素酶、木聚糖酶條件及其部分酶學性質研究

馬懷良，龔振杰，柴軍紅，彌春霞，孫佳琦，郭文學

（1.牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江 157012；2.牡丹江市綠珠果蔬技術開發有限責任公司，黑龍江 牡丹江 157000）

我國黑木耳產量居世界之首位，占世界總產量的90%以上，每年產生大量的菌糠，除一小部分被用作飼料、餌料及燃料外，絕大部分被丟棄，造成資源浪費并嚴重污染環境[1]。據研究，黑木耳菌糠中含有一定量纖維素酶[2]和木聚糖酶[3]，因此開發黑木耳菌糠中的纖維素酶和木聚糖酶，對于提高黑木耳行業收入，促進黑木耳行業良性發展具有重要意義。目前，提取黑木耳菌糠的纖維素酶和木聚糖酶常采用緩沖液浸提法[2]、水浸提法[3]或改良的水浸提法[4]。緩沖液浸提法由于成本高，不適于規模化生產。水浸提法浸提效率低，由于浸提時間較長，可能會造成酶水解；改良的水浸提法用高速組織搗碎機，菌糠內含物釋放較多，黏度高，增加了后續處理的難度，同樣不利于規?；a。針對這種情況，本研究采用超聲波浸提法，優化了浸提條件，并對粗酶液中的纖維素酶、木聚糖酶部分酶學性質進行了研究，旨在提高浸提效率，為黑木耳菌糠中的纖維素酶和木聚糖酶規模化生產及應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮黑木耳（Auricularia auricula）菌糠（采收3茬后）由牡丹江市綠珠果蔬技術開發有限責任公司提供。黑木耳栽培基質為：木屑80%，麩皮10%，米糠6%，玉米粉2%，石膏1%，石灰1%。隨機取100袋黑木耳菌糠，脫去菌袋，摘掉菌渣表面的菇蕾，用拌料機攪拌30 min，使其混合均勻。

1.2 主要儀器、試劑及配制方法

722N分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；VCX－130型超聲波破碎儀（輸出功率130W）（美國Sonics公司）；巧生牌中速定量濾紙；羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）（Sigma公司）；山毛櫸木聚糖（Sigma公司）；其余試劑為國產分析純。pH為5.5的0.1 mol·L－1乙酸－乙酸鈉緩沖溶液、1 mg·mL－1的葡萄糖標準溶液、1mg·mL－1木糖標準溶液、1%羧甲基纖維素鈉溶液、1%山毛櫸木聚糖溶液配制方法參考文獻[6]；3，5－二硝基水楊酸（DNS）溶液配制參見文獻[7]。

1.3 超聲條件

1.3.1 單因素試驗

以羧甲基纖維素酶活為指標，在25℃、工作時間為15 s、間歇時間5 s條件下，設定液料比40∶1，超聲時間20 min，超聲波振幅（Amplitude）為60%、70%、80%、90%、100%；其它條件不變，設定液比40∶1，振幅90%，超聲時間為10、15、20、25、30 min；其它條件不變，設定振幅90%，超聲時間為15 min，液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1。每處理設三次重復，計算平均酶活。

1.3.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以羧甲基纖維素酶活為指標，對振幅、超聲時間和液料比進行三因素三水平正交試驗，每試驗號組合設置3次重復，測定羧甲基纖維素酶活和木聚糖酶活，經統計分析得出最佳浸提條件。

1.3.3 對比試驗

應用兩種方法浸提黑木耳菌糠中的纖維素酶和木聚糖酶：一種采用超聲波法，按1.3.2得出的最佳浸提條件進行操作；一種采用水浸提法（對照），液料比為60∶1，置于恒溫振蕩培養箱中，溫度設為25 ℃，轉速100 r·min－1，浸提24 h。以上兩種方法均設置5次重復，測定羧甲基纖維素酶活和木聚糖酶活。

1.4 粗酶液制備

浸提結束后，將浸提液在4 000 r·min－1離心20 min后得到的上清液即為粗酶液。

1.5 酶活測定

羧甲基纖維素酶活（CMCase activity）和濾紙酶活（FPA）測定方法參見文獻[7]；木聚糖酶活（Xylanase activity）測定方法在羧甲基纖維素酶活基礎上，將底物換為1%山毛櫸木聚糖溶液、葡萄糖標準溶液換為木糖標準溶液，其余相同。

酶活定義：1 g黑木耳菌糠（干重）在50℃、pH 5.5條件下，1 min水解纖維素或木聚糖生成1 μmol葡萄糖或木糖的酶量定義為一個酶活單位，（IU·g－1）表示。

1.6 部分酶學性質

1.6.1 pH對纖維素酶和木聚糖酶活的影響

配制pH 4.0～7.2的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液[8]，并用pH計標定。在50℃條件下，分別測定粗酶液不同pH的FPA、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的活力。1.6.2 溫度對纖維素酶和木聚糖酶活的影響

在1.6.1最佳pH條件下，分別測定粗酶液不同溫度（30～90℃）的FPA、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的活力。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 振幅對浸提纖維素酶的影響

如圖1所示，振幅在60%～90%之間，隨著振幅增大，超聲波破碎菌糠菌絲細胞壁作用增加，有助于纖維素酶溶出。振幅為100%時，羧甲基纖維素酶活下降，其原因可能是超聲波劇烈振動破壞部分纖維素酶結構；另外，超聲作用進一步加速了浸提液的流動，從而減少了物料在超聲場中的停留時間，破壁作用也就隨之減弱[5]。

圖1 振幅對浸提羧甲基纖維素酶活性的影響Fig.1 Effects of amplitude on extracting CMCase

2.1.2 超聲時間對浸提纖維素酶的影響

如圖2所示，時間在5～15 min之間，隨著時間延長，菌絲細胞壁破碎度增加，羧甲基纖維素酶溶出量增加。當時間長于15 min，羧甲基纖維素酶活下降，這可能是時間過長，導致雜質溶出較多，抑制了酶活；或者超聲波機械剪切作用破壞了酶分子結構。

2.1.3 液料比對浸提纖維素酶的影響

如圖3所示，當液料比小于50∶1時，隨著液料比增加，羧甲基纖維素酶活呈增加的趨勢，原因是浸提液體積越大，溶劑與菌糠接觸越充分，在相同時間內溶解出更多的酶。當液料比高于50∶1時，羧甲基纖維素酶活下降，這可能是液料比過大，會消耗更多的時間和能量，增加超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降[5]，使酶的得率減少；也可能是液料比過大，浸提液中酶的濃度下降，致使降解底物速率較慢，導致酶活下降。

圖2 超聲時間對浸提羧甲基纖維素酶活性的影響Fig.2 Effects of processing time on extracting CMCase

圖3 液料比對浸提羧甲基纖維素酶活性的影響Fig.3 Effects of liquid-material ratio on extracting CMCase

2.2 正交試驗結果

以羧甲基纖維素酶活和木聚糖酶活為指標，對振幅、超聲時間和液料比進行L9（33）正交試驗，結果見表1。極差分析結果表明，影響浸提的主次順序為：液料比＞振幅＞時間。從多重比較結果來看，超聲波浸提黑木耳菌糠纖維素酶和木聚糖酶的最佳條件為：振幅90%、時間15 min、液料比為60∶1。

2.3 對比試驗

采用超聲波法浸提的纖維素酶活為平均值為7.500 IU·g－1，木聚糖酶活平均值為 4.921 IU·g－1；采用水浸提的纖維素酶活平均值為3.542 IU·g－1，木聚糖酶活平均值為1.818 IU·g－1。因此，超聲法浸提黑木耳菌糠纖維素酶和木聚糖酶酶活明顯優于水浸提法（P＜0.01）。

表1 正交試驗結果Table 1 Results of orthogonal experiments

2.4 部分酶學性質

2.4.1 pH對纖維素酶和木聚糖酶活的影響

結果見圖4。

圖4 pH對纖維素酶和木聚糖酶活性的影響Fig.4 Effects of pH on cellulase and xylanase acitivities

如圖4所示，羧甲基纖維素酶在pH4.0～5.2具有較高的酶活，最適pH為4.4，pH＞4.4時，酶活下降，至pH 6.4時酶活喪失；濾紙酶活在5.2、6.4及6.8時酶活較高，最適pH為5.2；木聚糖酶在4.0、4.8～6.8具有較高的酶活，說明此酶pH穩定范圍較寬，最適pH為4.8。

2.4.2 溫度對纖維素酶和木聚糖酶活的影響

結果見圖5。

圖5 溫度對纖維素酶和木聚糖酶活性的影響Fig.5 Effects of temperature on cellulase and xylanase acitivities

如圖5所示，羧甲基纖維素酶活（pH 4.4）和濾紙酶活（pH 5.2）在40～80℃酶活較高，最適溫度為60℃；木聚糖酶活（pH 4.8）在30～60℃酶活較高，最適溫度為50℃。

3 討論與結論

超聲波浸提黑木耳中的菌糠纖維素酶和木聚糖酶最佳條件為：振幅90%、時間15 min、液料比為60∶1；影響浸提的主次順序為液料比＞振幅＞時間；從浸提時間和酶活來看，超聲波浸提明顯高于水浸提法，具有較大的應用價值，適于規?；?、工廠化生產。

黑木耳浸提液中纖維素酶和木聚糖酶部分酶學性質為：羧甲基纖維素酶最適pH為4.4、最適溫度為60℃；濾紙酶最適pH為5.2、最適溫度為60℃；木聚糖酶最適pH為4.8、最適溫度為50℃。

粗酶液中木聚糖酶在pH 4.0、4.8～6.8范圍內，其酶活比較穩定，應用粗酶液時只需調整濾紙酶的pH即可，十分有利于粗酶液應用；濾紙酶在pH 5.2、6.4、6.8，酶活較高，特別是pH 6.8接近于中性，應用時可節省調節pH的化學藥品，可進一步降低成本。

在本研究中，濾紙酶具有較高的酶活，表明黑木耳菌糠纖維素酶分解天然纖維素的能力較強，特別是當pH≥6.4時，羧甲基纖維素酶活降為零，而濾紙酶活仍然較高，因此有必要對黑木耳菌糠纖維素酶系間協同效應進行研究探討。

目前在生產及應用時，評價纖維素酶活的高低，常以羧甲基纖維素酶為主要指標，但從本研究來看，纖維素酶活測定應以濾紙酶活為主[9]。

[1]趙桂云,龔振杰,陳歡.平菇菌糠替代木屑栽培茶薪菇和黑木耳[J].食用菌學報,2009,16(3):36－38.

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[3]張國慶,董曉芳,王賀祥等.8種食用菌菌渣中3種飼用酶活性的測定[J].中國食用菌,2009,28(5):28－29,56.

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[6]中華人民共和國農業部.NY/T 912－2004飼料添加劑纖維素酶活力的測定分光光度法[M].北京:中國農業出版社,2005.

[7]趙亞華.生物化學實驗技術教程[M].廣州:華南理工大學出版社,2000:149－151.

[8]劉葉青.生物分離工程實驗[M].北京：高等教育出版社,2007:187－188.

[9]馬懷良,郭文學,柴軍紅.常溫高效纖維素分解菌的篩選[J].東北農業大學學報,2010,41(1):52－55.