雙孢菇對殼聚糖保鮮劑的響應(yīng)及其保鮮技術(shù)優(yōu)化

李冠喜，華國棟，朱朋波，魏良志，王傲雪

（1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222006；2.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，南京 210037；3.連云港市海州區(qū)新壩鎮(zhèn)農(nóng)技中心，江蘇 連云港 222001；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

雙孢菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇、洋蘑菇，是世界上栽培最廣、產(chǎn)量最多、消費(fèi)最普遍的一種食用菌。近年來我國雙孢菇栽培發(fā)展迅速，產(chǎn)量和出口量現(xiàn)已超過美國躍居世界第一。

雙孢菇的貯藏保鮮問題一直是生產(chǎn)難題，制約其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[1]。雙孢菇菌蓋表面沒有保護(hù)結(jié)構(gòu)，不能阻止外界的物理傷害、微生物侵染及水分流失，比市場中的其他新鮮果蔬貨架期短，僅能保存3～4 d。另外，雙孢菇呼吸速率高及含水量多，使得雙孢菇極易產(chǎn)生微生物引起的腐爛和褐變現(xiàn)象。采后雙孢菇品質(zhì)降低主要表現(xiàn)為褐變、開傘、失水和質(zhì)地變化。因此，雙孢菇的保鮮技術(shù)已引起業(yè)內(nèi)關(guān)注，而目前采用的保鮮劑大都為化學(xué)合成[2]，保鮮效果不佳，且有毒性殘留，不符合綠色食品的發(fā)展要求，而用殼聚糖制成的純天然食用菌保鮮劑，保鮮效果顯著，可滿足食用菌貯藏、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)的保鮮要求。

殼聚糖可以抑制多種病原菌的生長，能夠誘導(dǎo)防御性酶如殼聚糖酶及在寄主組織中誘發(fā)植保因素[3]，形成的半透膜能夠改變果實組織內(nèi)部氣體組成和降低蒸發(fā)損耗[4]，抑制食用菌腐爛變質(zhì)，是食用菌理想的保鮮材料。目前，殼聚糖作為保鮮劑應(yīng)用在果蔬貯藏中的研究較多，而將其應(yīng)用在食用菌保鮮中的研究相對較少，且大多集中在參照果蔬貯藏法利用高分子量殼聚糖的成膜性制成涂抹劑進(jìn)行涂膜保鮮。

在雙孢菇的保鮮應(yīng)用中，高分子量的殼聚糖保鮮層成膜性較好但易使雙孢菇的外觀色澤發(fā)生改變而使其商品性降低，低分子量的殼聚糖成膜性稍差但抑菌效果好且可有效保持雙孢菇的原有色澤。為了闡明殼聚糖在雙孢菇貯藏保鮮中的作用，本實驗在優(yōu)化保鮮方案的基礎(chǔ)上，研究雙孢菇在殼聚糖保鮮劑的作用下各種理化指標(biāo)的變化，以期為深入探討食用菌貯藏保鮮機(jī)理的研究與生產(chǎn)實踐應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供體材料與保鮮劑母液的配制

雙孢菇由海州新壩豐泰食用菌公司提供。取3個1 000 mL燒杯，加入500 mL水，用檸檬酸溶解成1%溶液，加入0.5%氯化鈉，分別加入低、中、高分子殼聚糖7.5 g，配成1.5%溶液，如不溶解，則加入2.5 mL冰醋酸，溶解成透明溶液后加入以下物質(zhì)：維生素C 0.2%，半胱氨酸20 mg·kg－1。

1.2 保鮮方案優(yōu)化

采用正交設(shè)計L9（34）。

表1 L9 (34)因素水平Table 1 Factors and levels

1.3 考察指標(biāo)及方法

1.3.1 生理指標(biāo)的測定

失水：失水率（%）=（貯后菇體重量－貯前菇體重量）/貯前菇體重量×100%；褐變：按菇體褐變面積大小分為4級0級：無褐變1級：褐變面積小于1/4 2級：褐變面積大于1/4小于1/2 3級大于1/2；開傘：按菇體開傘面積大小分為4級1級：無開傘2級：開傘面積小于1/4 3級：開傘面積大于1/4小于1/2 4級開傘大于1/2；硬度：采用硬度計測量；腐爛程度：按菇體腐爛面積大小分為4級0級：無腐爛1級：腐爛面積小于1/4 2級：腐爛面積大于1/4小于1/2 3級大于1/2。

1.3.2 生化指標(biāo)的測定

選用優(yōu)化的殼聚糖復(fù)合保鮮液處理雙孢菇，置于PE袋4℃貯藏，測定各生化指標(biāo)。

1.3.2.1 可溶性蛋白含量的測定

參照Bradford[5]法，使用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 子實體總糖、還原糖含量的測定

在－20℃下冷凍完全后在真空干燥泵中干燥完全，然后用粉碎機(jī)粉碎干樣，其粉粒大小能過80目篩即可制成樣品。還原糖采用DNS法[6]，用1 mg·mL－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線；總糖采用苯酚硫酸法[7]，用0.1 mg·mL－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用失重法。失重率（%）=（初始鮮重－貯后鮮重）/初始鮮重×100%。

1.3.2.3 子實體MDA含量的測定：

參照Heath和Pacontroler[8]的方法:將1.0 mL粗酶提取液加入3.0 mL 0.5%的硫代巴比妥酸（TBA，用15%的三氯乙酸配成）溶液中，混勻后在沸水域中煮沸I8 min，迅速用自來水冷卻并在15 000 r·min－1離心機(jī)中離心10 min。取上清液在532和600 nm波長下分別測定光密度值。MDA含量（nmol·g－1·FW）。式中：A為反應(yīng)液總量（4 mL）；V為提取液總量（10.0 mL）；a為測定提取液量（1.0 mL）；FW材料鮮重（g）；1.55×10－1為MDA的微摩爾消光系數(shù)。

1.3.2.4 子實體相對電導(dǎo)率的測定：

準(zhǔn)確稱取5.0 g菇體，大小均一；每個菇體作四等分處剪切，置于去離子水清洗的燒杯（100 mL）中，加去離子水至40 mL，立即測定其電導(dǎo)率，記為P0；10min后再次測定其電導(dǎo)率，記為P1；然后煮沸10 min，冷卻至室溫，再次加去離子水至刻度，測定其電導(dǎo)率，記為 P2。電導(dǎo)率（%）=（P1－P0）/（P2－P0）×100%。

1.3.2.5 子實體多酚氧化酶（PPO）活性的的測定

參照Galeazzi等的方法[9]，并加以改進(jìn)：將0.2 mL粗酶提取液加入2.0 mL鄰苯二酚（用PBS 0.05 mol·L－1，pH 7.0配制成）中。反應(yīng)溫度30 ℃水浴中30 min，在410 nm處測定其吸光度，酶活以△OD410 nm·min－1·g－1·FW表示，重復(fù)3次。PPO活性（U·g－1·FW）=A×Vt/0.01×Vs×t×FW。式中A：樣品管吸光度；Vt：樣品提取液總體積（mL）；Vs：測定時取粗酶液量（mL）；t：顯色反應(yīng)時間（min）；FW：樣品重鮮（g）。

1.3.2.6 子實體超氧化物岐化酶（SOD）活性的測定

參照Constantine和Stanley[10]的方法，反應(yīng)液（總體積3.0 mL）含有 13 mmol·L－1蛋氨酸、0.075 mmol·L－1NBT、0.1 mmol·L－1EDTA、0.002 mmol·L－1核黃素以及0.1 mmol·L－1粗酶液（包含于50 mmol·L－1PBS，pH=7.8）。1個SOD的酶活單位定義為NBT被抑制率50%，其單位表示為unit/h/g·FW。SOD活性（U·g－1·FW）=（A0－AS）×Vt×60/A0×0.5×FW×Vs×t。式中A0：光下對照管吸光度；AS：樣品管吸光度；Vt：樣品提取液總體積（mL）；Vs：測定時取粗酶液量（mL）；t：顯色反應(yīng)時間（min）；FW：樣品重鮮（g）。

1.3.2.7 子實體過氧化氫酶（CAT）活性的測定

測定參照Kato and Shimizu[11]的方法。在含有0.1M PBS（pH=7.0）以及2 mmol·L－1H2O2的2.9 mL 反應(yīng)液中加入0.1 mL粗酶液，在240 nm處測定其初始吸光度的變化值（ε240＝40 mmol·L－1cm－1）。CAT活性（IU）=1 000×A×V/ε×d×v。式中A：240 nm處吸光度每分鐘變化量；V：反應(yīng)液總體積（mL）；ε：消光系數(shù)（M－1·cm－1）；d：光程（cm）；v：樣品測定時粗酶液量（mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果見表2、3。可知，各因子對失水率影響為：保存方式（D）＞糖種類（A）＞處理方式（C）＞糖濃度（B），最佳方案是D3A3C2B1，即，低分子殼聚糖，1%濃度噴灑，4℃PE袋保存效果最佳；各因子對硬度變化的影響為：保存方式（D）＞殼聚糖種類（A）＞噴灑方式（C）＞殼聚糖濃度（B），最優(yōu)方案為A3B1C2D3，即高分子殼聚糖0.5%濃度，浸泡300 s 4℃PE袋保存；各因子對腐爛程度的影響為：保存方式（D）＞殼聚糖種類（A）＞殼聚糖濃度（B）＞噴灑方式（C），最優(yōu)方案為A1B1C2D3，即低分子殼聚糖0.5%濃度浸泡300 s，置于PE袋4℃保存；各因子對開傘率的影響為：保存方式（D）＞殼聚糖種類（A）＞殼聚糖濃度（B）＞噴灑方式（C），最優(yōu)方案為A3B3C2D3，即高分子殼聚糖1.5%濃度浸泡300 s 4℃PE袋保存；各因子對褐變的影響為：保存方式（D）＞殼聚糖濃度（B）＞噴灑方式（C）＞殼聚糖種類（A），最優(yōu)方案為A3B3C2D3，即高分子殼聚糖1.5%濃度浸泡300 s置于PE袋4℃保存。考慮到農(nóng)藝操作的便利、商品性、成本等因素，宜選用低分子殼聚糖在雙孢菇采收前噴灑，采收后置于PE袋4℃保存，如果短期內(nèi)上市，也可考慮噴施保鮮劑后常溫保存。

表2 正交試驗計算結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of calculation

表3 正交試驗測定結(jié)果平均值Table 3 Average of orthogonal test results

2.2 殼聚糖保鮮劑對雙孢菇子實體可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白質(zhì)含量的下降是作為組織衰老的一個重要指標(biāo)，在蘑菇的采后貯藏中，大部分被分解用以滿足代謝需要。從圖1中可以看出，貯藏的1～16 d，處理組和對照組的可溶性蛋白都呈下降趨勢，對照組下降的幅度更大，經(jīng)顯著性分析，處理組和對照組樣品的可溶性蛋白含量差異極顯著（P＜0.01），說明處理組可溶性蛋白分解較慢，即代謝速度較慢。其后處理組下降速度明顯加快，隨著貯藏期延長，到19～25 d時處理組和對照組的下降趨勢基本一致，說明處理組的代謝速度加快，衰老加快，經(jīng)顯著性分析，處理組和對照組樣品的可溶性蛋白含量差異達(dá)顯著（P＜0.01）。以上說明保鮮劑能顯著降低雙孢菇子實體蛋白的分解速度，從而減緩子實體的衰老，達(dá)到保鮮的目的。

圖1 保鮮劑對雙孢菇子實體可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of antistaling agent on the soluble protein content of the fruit bodies

2.3 殼聚糖保鮮劑對雙孢菇子實體總糖、還原糖含量的影響

雙孢菇采收后總糖不斷被分解代謝，產(chǎn)生大量的還原糖，還原糖同時也被不斷做為呼吸底物被分解成H2O和CO2并產(chǎn)生能量或轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。圖2表明，總糖的水平總體呈下降趨勢，處理組在10～16 d保持較小的下降趨勢，且其含量明顯比對照高，其后下降趨勢加快，到25 d時和對照趨于一致，經(jīng)顯著性分析，無論是貯藏初期還是貯藏末期，處理組和對照組樣品的總糖含量均差異顯著（P＜0.05），說明殼聚糖能在一定程度上抑制總糖的分解。圖3表明，還原糖在整個貯藏的25 d里都在上升，但在4～16 d里其含量明顯低于對照，經(jīng)顯著性分析，其差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），其后和對照趨于一致。

2.4 殼聚糖保鮮劑對雙孢菇子實體丙二醛（MDA）含量的影響

植物器官衰老開在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受傷害的程度，其積累可能對膜和細(xì)胞造成一定的傷害。MDA能降低SOD、CAT和POD活性，加劇脂質(zhì)過氧化作用，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，使蛋白質(zhì)（酶）變性，降低膜脂的不飽和度和膜的流動性，使細(xì)胞膜的透性增大。由圖4可知，經(jīng)25 d的貯藏，處理組和對照組樣品的MDA含量由最初的6.102和7.171 nmol·g－1·FW 分 別 增 加 到 17.102 和 26.044 nmol·g－1·FW。這表明保鮮劑處理可降低脂肪的氧化程度。經(jīng)顯著性分析，無論是貯藏初期還是貯藏末期，處理組和對照組樣品的MDA含量均差異極顯著（P＜0.01），表明，保鮮劑處理可在一定程度上抑制雙孢菇的氧化損傷。

圖2 保鮮劑對雙孢菇子實體總糖的影響Fig.2 Effect of antistaling agent on the total sugar content of the fruit bodies

圖3 保鮮劑對雙孢菇子實體還原糖的影響Fig.3 Effect of antistaling agent on the reducing sugar content of the fruit bodies

2.5 殼聚糖保鮮劑對雙孢菇子實體相對電導(dǎo)率的影響

相對電導(dǎo)率是衡量組織細(xì)胞膜完整性的一個主要指標(biāo)，在貯藏過程中，細(xì)胞膜的透性加大，細(xì)胞中電解質(zhì)（主要是鉀離子）向外滲透速度加快，就會加速菇體的衰老和變質(zhì)。

圖4 保鮮劑對雙孢菇子實體丙二醛（MDA）含量的影響Fig.4 Effect of antistaling agent on the MDA content of the fruit bodies

圖5表明，在貯藏過程中，處理組和對照組的相對電導(dǎo)率都呈上升趨勢，但處理組始終低于對照組，且有顯著的差異（P＜0.05）。表明保鮮劑處理能有效地抑制細(xì)胞膜的損傷。

圖5 保鮮劑對雙孢菇子實體相對電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of antistaling agent on the relative conductivity in the fruit bodies

2.6 殼聚糖保鮮劑對雙孢菇子實體多酚氧化酶（PPO）活性的影響

植物組織酶褐變是由于PPO與酚類物質(zhì)的區(qū)域化分布打破后，PPO催化酚類物質(zhì)氧化形成的。PPO分布于細(xì)胞的質(zhì)體中，酚類物質(zhì)存在于液泡中，正常的細(xì)胞不會發(fā)生褐變。逆境或衰老等因素會刺激活性氧增加，損傷細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，打破PPO與酚類物質(zhì)的區(qū)域化分布，引起組織褐變。圖6表明，在前13～16 d里處理組和對照組的PPO活性在逐漸增加，對照組急速地達(dá)到峰值的時間是在第16 D，而處理組在第19 D時才出現(xiàn)峰值，但二者的差異并不顯著，此后，處理組和對照組的PPO活性隨著貯藏時間的延長而逐漸衰減趨于一致。說明，保鮮劑對雙孢菇的PPO活性并沒產(chǎn)生較大的影響，其減緩褐變發(fā)生的原因是保鮮劑可抑制膜脂氧化，維持細(xì)胞膜的完整性，從而避免了PPO與酚類物質(zhì)的接觸。

圖6 保鮮劑對雙孢菇子實體PPO活性的影響Fig.6 Effect of antistaling agent on the PPO activity in the fruit bodies

2.7 殼聚糖保鮮劑對雙孢菇子實體超氧化物岐化酶（SOD）活性的影響

SOD的活性變化如圖7所示。SOD作為氧自由基的酶性清除劑，經(jīng)殼聚糖保鮮劑處理后，其活性與對照組相比增加幅度較大，這說明殼聚糖處理增強(qiáng)了雙孢菇對氧自由基的清除能力。在貯藏過程中，處理組和對照組的SOD活性在第16d達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。經(jīng)顯著性分析，在貯藏過程中，處理組和對照組的SOD活性始終差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，保鮮劑處理可以使SOD活性保持在較高的水平，SOD通過清除氧自由基，從而減少活性氧物質(zhì)對雙孢菇的損傷來延長其貯藏期。

圖7 保鮮劑對雙孢菇子實體SOD活性的影響Fig.7 Effect of antistaling agent on the SOD activity in the fruit bodies

2.8 殼聚糖保鮮劑對雙孢菇子實體過氧化氫酶（CAT）活性的影響

植物在衰老時，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積，可以直接或間接氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等大分子，并使細(xì)胞膜受損害，從而加速細(xì)胞的衰老。過氧化氫酶可以清除H2O2，是植物體內(nèi)清除活性氧的重要保護(hù)酶之一。

由圖8可以看出，無論是處理組還是對照組中的過氧化氫酶活性都是先增加后減少，到第4天時達(dá)最大，經(jīng)顯著性分析，在貯藏過程中，處理組和對照組之間過氧化氫酶活性差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

圖8 鮮劑對雙孢菇子實體CAT活性的影響Fig.8 Effect of antistaling agent on the CAT activity in the fruit bodies

3 討論與結(jié)論

低分子質(zhì)量的殼聚糖具有較強(qiáng)的滲透性，滲入的氨基和羥基既能與果蔬細(xì)胞膜結(jié)合，又能除去果蔬催熟化合物（如醛類）和它們的中間體，從而調(diào)節(jié)果蔬貯藏過程中的生理生化變化，延長貯藏保鮮時間[12]。不同濃度的殼聚糖溶液，其粘度不同，形成的保鮮膜的疏密程度也不同，當(dāng)濃度太小時，成膜薄，對果蔬體內(nèi)與空氣的交換的阻力小，就會導(dǎo)致果蔬內(nèi)的O2濃度升高，呼吸作用增強(qiáng)，營養(yǎng)成分及有機(jī)酸消耗過快；當(dāng)濃度過高時，成膜過厚，使得果蔬內(nèi)的O2濃度太低，不能滿足正常呼吸，造成無氧呼吸，保鮮時間也短[13]。對雙孢菇來說，成膜過厚會影響其外觀色澤，進(jìn)而影響其商品性，宜選用低分子質(zhì)量的殼聚糖，濃度宜偏低但不宜過低，依靠其誘導(dǎo)防御性酶如殼聚糖酶及在寄主組織中誘發(fā)植保因素，從而達(dá)到保鮮效果[14]。

食用菌具有特殊的生長規(guī)律和采后生理活動，采收后仍有旺盛的生命力，當(dāng)其無法從培養(yǎng)基質(zhì)中獲得養(yǎng)分來滿足菌絲的生長需要時，就會降解自身在初級代謝階段合成和積累的生物大分子來保持生長的能量需要，從而導(dǎo)致品質(zhì)的下降[15]。食用菌采后采用不同的貯藏方式，效果不盡相同。本研究用不同分子質(zhì)量不同濃度的殼聚糖復(fù)合保鮮液處理雙孢菇子實體，并探討了處理后雙孢菇的生理生化變化和保鮮效果，結(jié)果表明：在貯藏過程中，雙孢菇子實體可溶性蛋白、總糖、還原糖的含量明顯高于對照；還原糖、MDA的含量、相對電導(dǎo)率均低于對照；SOD和CAT的活性明顯高于對照；殼聚糖能維持細(xì)胞膜的完整性，避免了PPO與酚類物質(zhì)的接觸，從而抑制了雙孢菇的褐變發(fā)生；殼聚糖能使起不同作用酶的活性保持在對貯藏保鮮有利的水平上，能夠延緩機(jī)體衰老。

果蔬細(xì)胞內(nèi)對過氧化有2類防御系統(tǒng)：一類是SOD、POD和CAT等酶促防御系統(tǒng)，另一類是抗壞血酸、還原性谷胱甘肽等非酶促防御系統(tǒng)。SOD、POD和CAT等是植物中重要的抗氧化系統(tǒng)。其中，SOD是植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵本科，它的作用是將O2－分解成H2O和O2。SOD和CAT或POD共同作用要清除體內(nèi)具有潛在危險的O2－和H2O2，從而最大限度減少活性氧的形成[16]。從本試驗可見，在貯藏過程中，處理組的SOD、POD和CAT的活性都比對照組有了顯著的提高，它們較高的活性可以使雙孢菇體內(nèi)的活性氧保持在較低的水平，減輕了自由基的毒害作用，延緩雙孢菇的衰老。

MDA是植物細(xì)胞膜酯過氧化的產(chǎn)物，是植物細(xì)胞受傷害的重要指標(biāo)；相對電導(dǎo)率則是能夠反映果蔬中細(xì)胞膜透性的生理指標(biāo)；超氧陰離子（O2－）生成量也是檢測植物衰老的重要指標(biāo)之一。這三者能在一定程度上反映植物細(xì)胞膜的完整程度[17]。從本試驗可見，在貯藏過程中，對照組的MDA含量、相對電導(dǎo)率都與對照相比有較大的降低。這說明在貯藏過程中，殼聚糖保鮮劑能有效地保持雙孢菇細(xì)胞膜的完整性，從而達(dá)到延長貯藏期和延緩腐爛的目的。

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