沉淀聚合法制備孔雀石綠分子印跡聚合物微球

徐 斐，張小剛，曹 慧

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

分子印跡技術（Molecular imprinting technology,MIT）是近幾十年發展起來的一種新型高效分離及分子識別技術。制備出的聚合物能夠特異性識別模板分子，被稱為“塑料抗體”，在色譜分離、固相萃取、生物傳感器等領域得到廣泛應用[1－3]。傳統的分子印記聚合物多采用本體聚合法制備，得到的產物為塊狀，需經過研磨、篩分才能使用，費時、費力且獲得的產物粒徑不均勻，部分識別位點在研磨過程中遭到破壞，導致識別性能下降。相比之下，MIP微球由于具有產量高、粒徑均一、吸附選擇性好等優點[4]，引起了人們的廣泛關注。目前，溶脹聚合法、懸浮聚合法、沉淀聚合法等都被用于MIP微球的制備[5－7]。

孔雀石綠是一種帶有金屬光澤的綠色結晶體，常作為驅蟲劑、殺菌劑等應用于水產養殖業中[8]。因其高毒、高殘留的特性，美國于1993年將孔雀石綠列為優先研究的致癌性化學物質，我國于2002年將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》。目前國內外對孔雀石綠的檢測多采用高效液相色譜、高效液相色譜－質譜聯用等方法，但這些方法需要對樣品進行排除干擾和分離富集等復雜的前處理工作[9]，傳統的富集方法大都是非特異性的，往往會同時富集干擾成分。為了提高富集效果，新型高選擇性識別基質的開發研制是非常必要的。分子印跡聚合物具有高度的選擇性和親和性，正符合了這一發展需求。

本文以孔雀石綠為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，采用沉淀聚合法制備了孔雀石綠的MIP，研究了其分子識別性能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孔雀石綠（MG，上海生科生物科技有限公司）；α－甲基丙烯酸（MAA，上海凌峰化學試劑有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA，安耐吉化學）；偶氮二異丁腈（AIBN，上海三浦化工有限公司）；甲醇、冰醋酸（國藥集團化學試劑有限公司）。

UV－6000紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；SK5200LH超聲清洗劑（上海科導超聲儀器有限公司）；SHZ－88臺式水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉市試驗設備廠）；HITACHI S－520掃描電鏡（日本日立集團）。

1.2 印跡聚合物微球的制備

在100 mL錐形瓶中加入0.5 mmol模板分子MG、2 mmol功能單體MAA和30 mL乙腈，于室溫下振蕩1 h，加入10 mmol交聯劑EGDMA和30 mg引發劑AIBN，超聲10 min后通N210 min，密封，于60℃恒溫水浴聚合24 h。用甲醇/乙酸（9/1，V/V）溶液對聚合物進行洗脫，直至無模板分子析出，60℃真空干燥至恒重，備用。

非印跡聚合物（NIP）的制備過程除不加模板分子，其他步驟同上。

1.3 模板分子與功能單體相互作用的紫外光譜研究

固定孔雀石綠乙腈溶液的濃度為0.01 mmol·L－1，加入不同濃度的功能單體，使模板分子與功能單體的物質的量分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6和1∶8，充分作用后以相應濃度的MAA作為參比，在190～300 nm波長范圍內進行掃描，觀察光譜的變化。

1.4 聚合物的吸附性能測定

稱取20 mgMIP、NIP放置試管中，分別加入3 mL不同濃度（0.5～20 μg·mL－1）的孔雀石綠乙腈溶液，放入水浴震蕩器中恒溫振蕩，24 h后移取適量上層清液，用乙腈稀釋至合適的濃度，于紫外分光光度計上測定吸光度。根據結合前后溶液中孔雀石綠的濃度變化計算聚合物對孔雀石綠的吸附量。吸附量按照公式（1）計算。

式中，C0－吸附前溶液的濃度（μg·mL－1），C－吸附后的平衡濃度（μg·mL－1），V－孔雀石綠乙腈溶液的體積（mL），W－聚合物的量（g）。

2 結果與分析

2.1 分子印跡聚合物的外觀形態

結果見圖1。

圖1 MIP(a)、NIP(b)的掃描電鏡Fig.1 SEM photograph of MIP(a)and NIP(b)

沉淀聚合物微球是在大量反應介質中形成的，沉淀聚合開始于均相的印跡分子、功能單體、交聯劑和引發劑的混合液。引發劑引發聚合，生成可溶于連續相的線型和支鏈的低聚物；隨著低聚物分子鏈增長，致使在連續相中的溶解度降低，最終從連續相中沉淀出來，形成聚合物核；聚合物核之間相互碰撞、聚集，并不斷吸收單體、自由基和低聚物后長大，形成聚合物微球[10]。由圖1可見，在相同條件下制備的非印跡聚合物和聚合物相比，形態無明顯差異，主要粒徑在0.5～1.5 μm之間，粒子之間存在一定的粘連。

2.2 孔雀石綠與MAA的結合機理

為預測聚合物的結合機理，通過紫外光譜研究了模板分子孔雀石綠與功能單體MAA間的相互作用。固定孔雀石綠的濃度，在乙腈溶液中分別加入不同濃度的MAA，預聚合溶液中孔雀石綠的紫外光譜如圖2所示。圖中可見，隨著MAA濃度的增加，孔雀石綠吸收光譜的最大吸收波長發生紅移，且波強度不斷下降，表明模板與單體之間形成了分子間作用力。

圖2 MG與不同比例的MAA混合液的紫外吸收光譜Fig.2 UV spectrum of MG-MAA at different mole ratios

模板分子孔雀石綠（A）與功能單體MAA（B）形成復合物，假定MAA的濃度b0遠大于MG的濃度a0，結合反應如下：

根據質量平衡方程，得

因為b0遠大于a0，因此式（4）中的[C]可以忽略，即

將式（3）和式（5）代入式（2），得

若溶液中在此波長處只有A和C兩物質有吸收，溶液的吸光度為

選用A的純樣品溶液為參比，可得差示吸光度ΔA

將式（8）代入式（6），整理得

式（9）中n為配合物的組成，可取簡單正整數n=1，2，…，以ΔA/b0n對ΔA作圖（見圖3），當n=2時為一良好直線，說明在研究的濃度范圍內主客體主要的存在形式為1個模板分子和2個功能單體分子相結合。

可以推測孔雀石綠分子印跡聚合物的合成路線（見圖4）。

圖3 MAA存在下204 nm處ΔA/b0 n對ΔA的關系Fig.3 Relation between ΔA/b0 nand ΔA at the wavelength of 204 nm with MAA

圖4 孔雀石綠與MAA的相互作用Fig.4 Interaction between MG and MAA

2.3 印跡聚合物的吸附特性

采用平衡吸附試驗考察印跡聚合物的結合特性。在孔雀石綠濃度為0.5～20 μg·mL－1范圍內，測定聚合物對不同初始濃度孔雀石綠溶液的結合量，結果見圖5。可見，在研究的濃度范圍內隨著孔雀石綠濃度的增加，單位質量MIP對模板孔雀石綠分子的吸附量也隨之增加，可以明顯地看出單位質量MIP的吸附量大于單位質量NIP的吸附量，表明在印跡聚合微球中存在特異的結合位點。

根據吸附等溫線數據，進行Scatchard分析[11]，考察聚合物對孔雀石綠的結合情況。Scatchard方程如下：

式中，Q為MIP對孔雀石綠的結合量（μg·g－1）；c為溶液中孔雀石綠的平衡濃度（μg·mL－1）；Qmax為結合位點最大表觀結合量；Kd為結合位點的平衡離解常數。

以Q/c對Q作圖得圖6。由圖6可知，Q/c對Q呈非線性關系，說明聚合物中的結合位點是非均一性的。圖6中有2個部分成線性關系，據此判斷在測定的濃度范圍內，MIP對孔雀石綠分子存在兩類不同的結合位點。由兩端直線的斜率和截距可近似求得高親和力結合位點的平衡離解常數Kd1=11.223 μg·mL－1，最大表觀結合量Qmax1=4.45×102μg·g－1；低親和力結合位點的平衡離解常數Kd2=156.25 μg·mL－1，最大表觀結合量Qmax2=5.033×103μg·g－1。

圖5 孔雀石綠印跡聚合物的結合等溫線Fig.5 Binding isotherm of MG-MIP

圖6 MIP的Scatchard曲線Fig.6 Scatchard curve of MIP

3 結論

以孔雀石綠為模板分子，α－甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，偶氮二異丁腈為引發劑，乙腈為溶劑，采用熱聚合的方法制備了孔雀石綠分子印跡聚合物。印跡聚合物和非印跡聚合物形態上無明顯差異，粒徑在0.5～1.5 μm間。印跡聚合物中存在兩類不同的結合位點，對模板分子的吸附明顯高于非印跡聚合物。該材料用于樣品中痕量孔雀石綠獸藥殘留的分離富集和分析前景廣闊，尤其是在復雜樣品的前處理過程中得到應用。

[1]歐俊杰,董靖,吳明火,等.分子印跡整體柱在高效液相色譜和電色譜手性分離中的應用[J].色譜,2007,25(2):129－134.

[2]Jesus M,Bueno M,Herrera S,et al.Determination of malachite green residues in fish using molecularly imprinted solid－phase extraction followed by liquid chromatography－linear ion trap mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2010,665:47－54.

[3]Chang P P,Zhang Z J,Yang C Y.Molecularly imprinted polymer－based chemiluminescence array sensor for the detection of proline[J].Analytica Chimica Acta,2010,666:70－75.

[4]Yan H Y,Kyung Ho Row.Characteristic and synthetic approach of molecularly imprinted polymer[J].Int J Mol Sci,2006(7):155－178.

[5]Masanori Nakamura,Masaki Ono,Toshiaki Nakajima,et al.Uniformly sized molecularly imprinted polymer for atropine and its application to the determination of atropine and scopolamine in pharmaceutical preparations containing Scopolia extract[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2005,37:231－237.

[6]Richard J A,Klaus M.Molecularly imprinted polymers by suspension polymerisation in perfluorocarbon liquids,with emphasis on the influence of the porogenic solvent[J].Journal of Chromatography A,1997,787:55－66.

[7]Liu Y Q,Kaori H,Jun H.Monodispersed,mole－cularly imprinted polymers for cinchonidine by precipitation polymerization[J].Talanta,2010,80:1713－1718.

[8]Sandra J C,Frederick A B.Malachite Green:A Toxic－ological Review[J].International Journal of Toxicology,1996,15:219－238.

[9]Bergeerff A A,Scherpenisse P.Determination of residues of malachite green in aquatic animals[J].Journal of Chromatography B,2003,788:351－359.