鼠李糖乳桿菌（ATTC53103）高密度生產(chǎn)工藝研究

陳 成，韓建春

（1.黑龍江省輕工科學(xué)研究院，哈爾濱 150010；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）屬于乳桿菌（Lactobacillus）屬、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）種，革蘭氏陽性菌，無質(zhì)粒；不能利用乳糖，但可代謝單糖。上世紀(jì)80年代，該菌株由兩位美國科學(xué)家Sherwood Gorbach和Barry Goldin從健康人的腸道中分離而得，并命名為鼠李糖乳桿菌LGG（Lactobacillus rhamnosus GG）[1－4]。近年來，國外的科學(xué)家通過大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體臨床實(shí)驗(yàn)證明LGG能夠耐受動(dòng)物消化道環(huán)境，并能夠在人和動(dòng)物腸道內(nèi)定殖，起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、預(yù)防齲齒和提高機(jī)體免疫力等作用[5]。

高密度培養(yǎng)技術(shù)，也就是高密度發(fā)酵技術(shù)，由于不同菌株所能達(dá)到的最高菌體濃度相差較大，目前的文獻(xiàn)中對高密度培養(yǎng)尚無確切定義。一般來說，高密度培養(yǎng)是指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)或裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較分批培養(yǎng)有顯著提高，最終提高特定產(chǎn)物的生產(chǎn)率。常用的高密度培養(yǎng)方法有分批補(bǔ)料培養(yǎng)、過濾培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)等。

本文就鼠李糖乳桿菌的特性對其高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，通過制定高密度凍干菌粉最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)濃縮型乳酸菌粉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

鼠李糖乳桿菌ATTC 53103（Lactobacillus rhamnosus ATTC 53103）。

1.1.2 培養(yǎng)基配方[12]

MRS培養(yǎng)基（液體）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二胺2 g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH為6.3～6.5，115℃，15min滅菌。

MRS培養(yǎng)基（固體）：在液體培養(yǎng)基中加入1%～2%瓊脂，加熱融化后，115℃，15min滅菌。

12%（W/W）脫脂乳：將13.6 g脫脂乳溶于100 mL蒸餾水中，115℃，15 min滅菌。

稀釋液的配制：NaCl 0.85 g，胰蛋白胨0.15 g，蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化

Nvazzaro等試驗(yàn)證明葡萄糖以及酵母粉對鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）有較好的增殖作用，他們培養(yǎng)出的最大活菌數(shù)達(dá)到2.2×109cfu·mL－1[4]，Miller也給出類似結(jié)論[7]。固定12%的脫脂乳粉以及0.15%的吐溫80用量，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（L9（33））優(yōu)化葡萄糖、蛋白水解物和酵母粉的用量，因素水平見表1。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平（L（9 33））Table 1 Level of orthogonal design of basic culture (%)

1.2.2 培養(yǎng)方式對高密度發(fā)酵的影響

本試驗(yàn)利用500 mL鹽水瓶和10 L發(fā)酵罐進(jìn)行分批培養(yǎng)，通過研究發(fā)酵過程中菌體濃度與pH和發(fā)酵液內(nèi)葡萄糖濃度的關(guān)系，確定抑制菌株進(jìn)一步增殖的因素，并確定各因素對菌株的影響方式和極限值。在此基礎(chǔ)上，通過對10 L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，調(diào)整罐內(nèi)發(fā)酵液的pH與葡萄糖濃度，達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

本試驗(yàn)以活菌數(shù)為指標(biāo)，采用L9（33）對基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果見表2。極差分析和方差分析分別見表3與4。

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果（L（9 33））Table 2 Results on orthogonal design of basic culture (%)

通過表3極差分析結(jié)果可以看出，影響培養(yǎng)基增菌效果的主次因素為：A＞B＞C，即葡萄糖濃度＞酵母粉濃度＞酪蛋白水解物濃度。從表4方差分析也可得到同樣結(jié)論，A、B、C三個(gè)因素對鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）基礎(chǔ)培養(yǎng)基菌數(shù)的影響達(dá)到顯著水平，說明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。從上述分析可知最佳組合為A3B3C3，葡萄糖濃度為10%、酵母粉濃度為1.0%、酪蛋白水解物濃度為2.0%。此組合不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，因此需要做驗(yàn)證試驗(yàn)。按上面最佳條件A3B3C3，平行做3次試驗(yàn)，得菌數(shù)為6.28×108cfu·mL－1，高于正交試驗(yàn)中的最大活菌濃度6.22×108cfu·mL－1。因此較優(yōu)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件為：葡萄糖濃度為10%、酵母粉濃度為1.0%、酪蛋白水解物濃度為2.0%。

表3 培養(yǎng)基優(yōu)化的極差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis

表4 方差分析Table 4 Anova analysis

由表4的方差分析可知，試驗(yàn)中所選用的三個(gè)因素中蔗糖和酵母粉對活菌數(shù)有顯著影響，而酪蛋白水解物對活菌數(shù)影響相對較小。

2.2 高密度發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)與pH和葡萄糖濃度關(guān)系

2.2.1 鹽水瓶分批培養(yǎng)發(fā)酵過程曲線

鹽水瓶發(fā)酵過程曲線如圖1所示。由圖1中可以看出，培養(yǎng)2 h后發(fā)酵液的pH開始快速下降，4～14 h為菌體生長的對數(shù)生長期，菌體濃度增加迅速；由于生成的乳酸和乙酸在發(fā)酵液中積累，14 h菌體濃度達(dá)到最高值，為3.15×109cfu·mL－1，對應(yīng)的發(fā)酵液pH降為4.6，葡萄糖濃度為6.2 g·L－1。進(jìn)入穩(wěn)定期后，由于酸度的升高以及營養(yǎng)物質(zhì)的減少，活菌數(shù)濃度逐漸呈下降趨勢，18 h活菌數(shù)為3.08×109cfu·mL－1。

圖1 鹽水瓶分批培養(yǎng)發(fā)酵過程曲線Fig.1 Fermentation curve of bottle batch culture

2.2.2 發(fā)酵罐分批培養(yǎng)發(fā)酵過程曲線

發(fā)酵罐分批培養(yǎng)發(fā)酵過程曲線如圖2所示。菌株在4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體開始快速利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵液的pH和葡萄糖濃度下降速度逐漸加快，12 h左右達(dá)到對數(shù)生長期末期，此時(shí)pH為4.4，葡萄糖濃度為5.7 g·L－1，最大活菌數(shù)為3.8×109cfu·mL－1。

圖2 發(fā)酵罐分批培養(yǎng)發(fā)酵過程曲線Fig.2 Fermentation curve of fermenter batch culture

2.3 補(bǔ)料高密度培養(yǎng)發(fā)酵過程曲線的測定

張?zhí)m威的研究表明，發(fā)酵液酸度的上升以及營養(yǎng)物質(zhì)濃度的下降是乳酸菌增殖停止及衰亡的主要原因[8]。在篩選增殖培養(yǎng)基的試驗(yàn)中已經(jīng)證明葡萄糖濃度對鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）的增殖最為關(guān)鍵，如果發(fā)酵液的pH和葡萄糖濃度能在菌株增殖過程中保持穩(wěn)定，那么菌株達(dá)到對數(shù)生長期末期的時(shí)間將得到延長，最大活菌數(shù)也會(huì)相應(yīng)提高。因此可以通過流加堿液及補(bǔ)加葡萄糖的方式實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的目的。

2.3.1 補(bǔ)料培養(yǎng)pH及葡萄糖濃度的確定

發(fā)酵罐分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對數(shù)生長期末期發(fā)酵液的pH為4.4，此后菌株進(jìn)入穩(wěn)定期及衰亡期。這就意味著低于4.4的pH有可能會(huì)抑制菌株繼續(xù)增殖，我們選擇將發(fā)酵液的pH分別保持5.0、6.0和7.0，測定發(fā)酵液達(dá)到最大活菌數(shù)時(shí)間和達(dá)到最大活菌數(shù)時(shí)的葡萄糖濃度，如表5所示。

表5 發(fā)酵罐保持不同pH菌株生長情況比較Table 5 Compare of growth curve at different pH

將發(fā)酵液pH保持在6.0時(shí)，鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）在增殖培養(yǎng)基中達(dá)到最大活菌數(shù)為2.9×1010cfu·mL－1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分批培養(yǎng)的最大活菌數(shù)（發(fā)酵罐分批培養(yǎng)的最大活菌數(shù)是3.8×109cfu·mL－1），證明此pH有利于鼠李糖乳桿菌的增殖，此時(shí)活菌濃度不能繼續(xù)增加的原因應(yīng)該是培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度的下降。

在保持pH 6.0的發(fā)酵試驗(yàn)中，達(dá)到最大活菌數(shù)時(shí)葡萄糖濃度為1.9 g·L－1，此時(shí)的葡萄糖濃度有可能成為菌株增殖的抑制因素。保持發(fā)酵液的pH 6.0，分別在發(fā)酵液的糖濃度降至2、4、6、8 g·L－1時(shí)補(bǔ)加葡萄糖，使發(fā)酵液的葡萄糖濃度分別保持在2～4、4～6、6～8和8～10 g·L－1的范圍內(nèi)，并在這個(gè)過程中測定最大活菌數(shù)，如圖3所示：在糖濃度降至2 g·L－1后補(bǔ)糖，最大活菌數(shù)為3.18×1010，糖濃度降至4、6、8 g·L－1后補(bǔ)糖，最大活菌數(shù)結(jié)果差異不大，均為3.7×1010左右。因此，選擇補(bǔ)糖的最低糖濃度是4 g·L－1。

圖3 不同糖濃度的最大活菌數(shù)比較Fig.3 Compare of the max viable account at different glucose concentration

2.3.2 高密度培養(yǎng)補(bǔ)料方法的確定

發(fā)酵罐的pH探頭能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測發(fā)酵液的pH變化，因此采取恒流補(bǔ)堿的方法，滴加15%的NaOH溶液，使發(fā)酵液的pH保持在6.0±0.1。

葡萄糖的補(bǔ)加應(yīng)根據(jù)實(shí)際發(fā)酵情況而定，當(dāng)葡萄糖濃度降至4g·L－1時(shí)開始第1次補(bǔ)糖，初次應(yīng)補(bǔ)充10%的滅菌葡萄糖170mL，使糖濃度升至6g·L－1。當(dāng)葡萄糖濃度降至4 g·L－1左右時(shí)重復(fù)補(bǔ)加葡萄糖，整個(gè)過程保持葡萄糖濃度在4～6 g·L－1范圍內(nèi)。

2.3.3 補(bǔ)料高密度培養(yǎng)的生長曲線

根據(jù)發(fā)酵罐分批培養(yǎng)的發(fā)酵特點(diǎn)，通過控制發(fā)酵液的最低葡萄糖濃度，恒定發(fā)酵液的pH，達(dá)到增加最大活菌數(shù)的目的。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，測定的活菌濃度為縱軸繪制曲線，即為鼠李糖乳桿菌（ATTC53103）補(bǔ)料高密度培養(yǎng)的生長曲線，如圖4所示。

0～6 h為菌體生長的延滯期，6～20 h為菌體的對數(shù)生長期，20～30 h為菌體的穩(wěn)定期，與發(fā)酵罐分批培養(yǎng)相比，菌體對數(shù)生長期延長約4 h，最大活菌數(shù)提高近10倍。

2.3.4 補(bǔ)料高密度培養(yǎng)葡萄糖曲線

分別以培養(yǎng)時(shí)間和測定的葡萄糖濃度作為橫縱軸繪制曲線，即為鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）補(bǔ)料高密度培養(yǎng)葡萄糖濃度曲線。如圖5所示。

發(fā)酵液中的葡萄糖初始濃度為l%，葡萄糖濃度在前4 h后變化緩慢，4～12 h內(nèi)的葡萄糖濃度下降加速，12 h后葡萄糖濃度降至3.9 g·L－1。此時(shí)第一次向罐內(nèi)補(bǔ)加葡萄糖，6～24 h為菌體加速消耗葡萄糖階段，期間共補(bǔ)充葡萄糖7次。

圖4 補(bǔ)料高密度培養(yǎng)生長曲線Fig.4 Growth curve of fed-batch high-density culture

圖5 補(bǔ)料高密度培養(yǎng)葡萄糖濃度曲線Fig.5 Glucose curve of fed-batch high density culture

3 討論

世界范圍內(nèi)，就益生菌研發(fā)的專業(yè)化及系統(tǒng)性而言，日本和法國處于領(lǐng)先地位，且這兩個(gè)國家的益生菌產(chǎn)品市場尤為活躍。早在20世紀(jì)30年代，日本京都帝國大學(xué)的代田稔教授就已成功分離出來源于人體腸道的乳酸桿菌，該株菌經(jīng)過強(qiáng)化培養(yǎng)后能定殖于人體腸道內(nèi)。這種后來被人們稱為養(yǎng)樂多菌的乳酸桿菌已被廣泛使用在日本的食品、飲品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，其中在乳制品上的運(yùn)用成果顯著。據(jù)國外有關(guān)公司調(diào)查；日本在2000年利用益生菌生產(chǎn)的乳制品，其總產(chǎn)值就已達(dá)22億美元。而今的養(yǎng)樂多在日本已家喻戶曉，日本人利用養(yǎng)樂多菌制作的活性發(fā)酵乳飲料成功打入國際市場，目前該產(chǎn)品已進(jìn)入13個(gè)國家，全球每天至少2 500萬人在飲用這種產(chǎn)品。法國在益生菌方面的研究不亞于日本，目前該國已擁有一支龐大而專業(yè)化的益生菌科研隊(duì)伍，每年研究開發(fā)經(jīng)費(fèi)高達(dá)數(shù)億歐元。法國人對益生菌非常認(rèn)同，益生菌產(chǎn)品市場也很發(fā)達(dá)。一種不依賴于藥物的益生菌保健法，其源頭就在法國。益生菌在我國的研究與利用起步較遲，在基礎(chǔ)研究和開發(fā)利用方面，與發(fā)達(dá)國家都存在一定的差距，20世紀(jì)的中后期大部分學(xué)者中斷了對益生菌的研究。因此，這一時(shí)期我國關(guān)于益生菌方面的研究論文或科研成果寥寥無幾。進(jìn)入21世紀(jì)后狀況有所改觀，益生菌的研究已開始復(fù)蘇，益生菌的應(yīng)用也受到了重視。例如廣東省食品學(xué)會(huì)、廣東微生物學(xué)會(huì)等機(jī)構(gòu)此前曾經(jīng)舉辦過兩屆益生菌研討會(huì)；有關(guān)奶業(yè)協(xié)會(huì)在黑龍江也召開過乳酸菌專題高層論壇；上海奶業(yè)界亦曾邀請美國等國的乳酸菌專家云集上海召開了國際性的乳酸菌研討交流會(huì)。國內(nèi)由中國食品學(xué)會(huì)牽頭，知名乳品配料企業(yè)丹尼斯克、大型乳品生產(chǎn)企業(yè)伊利等參與成立了乳酸菌協(xié)會(huì)。另外，在國內(nèi)也相繼涌現(xiàn)出哈爾濱美華、北京弗蒙特以及上海潤盈等面向工業(yè)客戶專業(yè)生產(chǎn)微生態(tài)產(chǎn)品的企業(yè)。2000年我國已有9類獲得衛(wèi)生部批準(zhǔn)的國家一類活菌制劑，即口服雙歧桿菌活菌制劑（回春生、麗腸樂）、口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌制劑（培菲康）、口服地衣芽孢桿菌活菌制劑（整腸生）及金雙歧等等。

鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）屬于乳桿菌（Lactobacillus）屬、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）種，革蘭氏陽性菌，無質(zhì)粒；不能利用乳糖，但可代謝單糖。該菌株在LBS番茄汁瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基中生長呈現(xiàn)特定的形態(tài)學(xué)特征：大的奶油白色不透明菌落，且散發(fā)奶油味道。鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）是目前世界上研究最為深入，應(yīng)用最為廣泛的益生菌之一，在芬蘭，美國，澳大利亞，日本等全球30多個(gè)國家及地區(qū)有上百種含有該菌株的產(chǎn)品銷售，主要為發(fā)酵乳制品及膠囊保健品，該菌株耐酸性良好，在腸道定殖能力強(qiáng)。高密度培養(yǎng)技術(shù)（High cell－density culture），也就是高密度發(fā)酵技術(shù)，由于不同菌株所能達(dá)到的最高菌體濃度相差較大，一般來說，高密度培養(yǎng)是指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)或裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較分批培養(yǎng)有顯著的提高，最終提高特定產(chǎn)物的比生產(chǎn)率。常用的高密度培養(yǎng)方法有分批補(bǔ)料培養(yǎng)、過濾培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)等。在分批培養(yǎng)條件下菌株數(shù)量和產(chǎn)物在經(jīng)過一段培養(yǎng)時(shí)期后達(dá)到不再增加的穩(wěn)定狀態(tài)，主要原因是可利用底物的耗盡和抑制物的積累。如果能去除這兩方面對微生物生長的限制，微生物細(xì)胞將有可能達(dá)到更高密度。當(dāng)可利用底物的耗盡是細(xì)胞不再增殖的主要原因時(shí)，利用重復(fù)加入底物的方法可以提高生物量；如果是抑制物的積累引起細(xì)胞停止增長，底物不能被完全利用，單純加入底物就不再能解決問題，需要利用某種方法去除抑制物才能使細(xì)胞濃度進(jìn)一步增加。對人體有著豐富而顯著的功能特性。該菌株具有耐胃酸、耐膽汁、可定植于人體腸道、產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)量能夠保持相對恒定等特點(diǎn)。很多乳制品及保健品企業(yè)對該菌株表現(xiàn)了濃厚的興趣，因此工業(yè)化生產(chǎn)出高密度的鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）凍干粉存在較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及社會(huì)效益。

4 結(jié)論

通過單因素及正交試驗(yàn)篩選出高密度增殖培養(yǎng)基，主要成分如下：脫脂奶粉12%、葡萄糖10%、平菇汁8%、啤酒8%、番茄汁5%、酪蛋白水解物2%、酵母粉1%、吐溫80為0.15%。采用此增殖培養(yǎng)基，最大活菌濃度可達(dá)3.02×109cfu·mL－1；鼠李糖乳桿菌（ATTC 53103）10 L自動(dòng)發(fā)酵罐補(bǔ)料高密度培養(yǎng)條件為：葡萄糖濃度低于4 g·L－1時(shí)補(bǔ)加葡萄糖，使罐內(nèi)葡萄糖濃度穩(wěn)定在4～6 g·L－1之間。在此條件下發(fā)酵20 h，最大活菌數(shù)可達(dá)到3.75×1010cfu·mL－1，而發(fā)酵罐分批培養(yǎng)最大活菌濃度僅為3.8×109cfu·mL－1，前者比后者提高近10倍。

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