高產γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的篩選及誘變育種研究

吳 非，邊 鑫，李 良，吳海波，郭 麗

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術研究中心，哈爾濱 150050；3.綏化學院生物與食品工程系，黑龍江 綏化 152061）

γ－氨基丁酸（γ－aminobuyric acid，GABA）是一種廣泛分布于動、植物中的非蛋白質氨基酸[1]，是哺乳動物腦內的抑制性遞質。近年來，隨著對GABA的研究不斷深入，其降血壓[2]、治療癲癇[3]和焦慮癥[4]等眾多功效相繼被發現，使得GABA受到食品、醫療行業人士的廣泛關注。因此，如何提高GABA的含量成為目前國內外的研究熱點。目前，GABA主要是通過谷氨酸脫羧酶（GAD）催化谷氨酸轉化而成的[5]。研究發現，乳酸菌、霉菌、酵母菌以及其他微生物中含有這種酶[6－8]，可通過提取出的GAD催化谷氨酸轉化或微生物發酵來生產GABA。本研究從食用級乳酸菌著手，以豆漿（大豆∶水=1∶8）為發酵基質進行發酵，篩選出GABA的高產菌株，然后利用紫外線對高產菌株進行誘變處理，將得到的突變菌株用含有代謝產物GABA的培養基進行抗性初篩，再依次利用含有1%谷氨酸的改良MRS培養基和豆漿發酵進行復篩及遺傳穩定性試驗，最終得到穩定高產GABA突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）L1，L2，L12，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.），均由乳品科學教育部重點實驗室提供。

1.1.2 試劑

GABA標準品（美國Sigma公司）；四硼酸鈉（天津市光復精細化工研究所）；次氯酸鈉（天津富宇精細化工有限公司）；苯酚（沈陽東興試劑廠）；乙醇（天津市海濱科迪化學試劑有限公司）。

1.1.3 培養基

改良MRS培養基：蛋白胨5 g，胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，乙酸鈉5 g，吐溫－80 1 g，檸檬酸二胺2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水1 000 mL，調pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 豆漿的制備

取大豆加水浸泡6～8 h，瀝干后，把泡好的大豆用豆漿機研磨，用紗布過濾。向豆渣中加入適量的純凈水，充分攪拌后，磨濾兩次。把3次磨濾制得的漿液混合，再加入適量純凈水混勻，使豆漿中大豆和水的比例為1∶8。然后，用八層紗布過濾4次。

1.2.2 GABA含量的測定方法

本文采用Berthefot比色法[9]測定發酵液中GABA的含量。

1.2.3 乳酸菌菌株的活化

從乳酸菌凍存管中取300 μL菌液，接入10 mL改良MRS液體培養基中，40℃下活化培養24 h，然后，從10 mL改良MRS液體培養基中吸取1.5 mL菌液于50 mL改良MRS培養基中，40℃下培養18 h。再從50 mL改良MRS中吸取3 mL菌液于100 mL改良MRS培養基中，40℃下培養16 h后備用。

1.2.4 高產GABA乳酸菌菌株篩選

將6株活化的乳酸菌菌株接種于改良MRS液體培養基中，40℃靜置培養至其穩定期。取7個三角瓶分別倒入等量的豆漿，用封口膜封好，進行巴氏殺菌。殺菌后，取其中一個三角瓶中的樣品，測其GABA含量。然后，將不同乳酸菌以3%的接種量分別接到剩下的6個三角瓶中。在40℃恒溫條件下發酵12 h。發酵期間每隔1 h取樣1次，測定GABA含量，通過GABA含量的比較，獲得高產GABA乳酸菌菌株。

1.2.5 高產GABA乳酸菌菌株紫外誘變、抗性初篩及復篩

1.2.5.1 菌懸液的制備

將菌株以3%的接種量接種于含1%谷氨酸的改良MRS液體培養基中，培養至對數期后，取20 mL菌液離心（6 000×g，4℃，15 min），棄上清液，用無菌生理鹽水將沉淀溶解，調整菌數約為108cfu·mL－1，即得菌懸液[10]。

1.2.5.2 紫外誘變處理、抗性初篩及復篩

取6 mL菌懸液注入9 cm培養皿中，將培養皿置于磁力攪拌器上，先打開紫外燈（18 W，距離45 cm）預熱20 min，再打開磁力攪拌器，將皿蓋取下，用紫外燈垂直照射10、20、30、40、50和60 s。然后，取照射菌液1 mL分別稀釋102、103、104、105、106、107。再將不同稀釋度的菌液涂布于含適當濃度GABA的改良MRS平板上，同時以未誘變菌株的平板作對照，避光置于40℃的恒溫培養箱中培養48 h，進行菌落計數，計算致死率。取致死率在90%以上的單菌落轉接于含1%谷氨酸的改良MRS液體培養基中，40℃下靜置培養24 h后，測定GABA含量，進行抗性初篩，并計算正突變率。

取GABA含量較高的正突變菌株，分別以3%的接種量接入豆漿中，在40℃恒溫條件下發酵，根據發酵過程中GABA最大產量進行復篩，最終獲得高產GABA乳酸菌突變菌株。

1.2.6 高產GABA乳酸菌突變菌株遺傳穩定性分析

將經過篩選得到的高產乳酸菌突變菌株連續傳代12次，每3代取一次菌液進行發酵，測定發酵液中GABA含量，以確定其遺傳穩定性。

1.2.7 統計分析

原始數據的整理采用Microsoft Excel 2003進行,每組試驗樣品均作3個重復進行檢測。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵豆漿過程中GABA積累量隨發酵時間的變化

將6株乳酸菌培養至穩定期后，進行接菌發酵，通過豆漿發酵過程中GABA積累量篩選出高產GABA乳酸菌菌株。6株乳酸菌菌株的GABA積累量隨發酵時間的變化情況見表1。

由表1可見，豆漿本身就含有GABA，含量為0.819 g·L－1。同時發現6株菌株在發酵2 h左右開始生產GABA，當發酵7 h時，乳酸乳球菌乳酸亞種的GABA產量首先到達最大值，為0.702 g·L－1；當發酵8 h時，保加利亞乳桿菌L2和L12的GABA產量達到最大值，分別為1.066和0.609 g·L－1；當發酵9 h左右時，副干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌L1的GABA產量達到最大值，分別為0.755和0.776 g·L－1；而當發酵到10 h左右時，嗜熱鏈球菌的GABA產量才達到最大值，為0.909 g·L－1。通過對GABA產量的比較，可以看出，保加利亞乳桿菌L2的GABA產量最大，因此，可以確定保加利亞乳桿菌L2為高產GABA乳酸菌。

表1 乳酸菌在發酵過程中GABA積累量隨發酵時間的變化情況(ˉ±S)Table 1 GABA accumulation along with the change of fermentation time by Lactobacillus during fermentation

表1 乳酸菌在發酵過程中GABA積累量隨發酵時間的變化情況(ˉ±S)Table 1 GABA accumulation along with the change of fermentation time by Lactobacillus during fermentation

GABA積累量（g·L－1）Accumulation發酵時間（h）Time 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12保加利亞乳桿菌L1 Lactobacillus bulgaricus L1 0.819±0.018 0.831±0.045 0.874±0.100 0.938±0.085 0.996±0.008 1.089±0.011 1.158±0.029 1.265±0.067 1.417±0.092 1.595±0.074 1.381±0.058 1.204±0.071 1.362±0.088保加利亞乳桿菌L12 Lactobacillus bulgaricus L12 0.819±0.078 0.828±0.013 0.849±0.099 0.885±0.063 0.928±0.011 1.012±0.073 1.128±0.023 1.249±0.089 1.428±0.071 1.401±0.055 1.225±0.005 1.323±0.087 1.292±0.051保加利亞乳桿菌L2 Lactobacillus bulgaricus L2 0.819±0.024 0.855±0.141 0.947±0.027 1.074±0.058 1.202±0.011 1.397±0.014 1.539±0.007 1.757±0.042 1.885±0.007 1.830±0.059 1.502±0.072 1.721±0.037 1.639±0.012嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus 0.819±0.053 0.839±0.071 0.853±0.054 0.879±0.082 0.958±0.014 1.038±0.050 1.113±0.078 1.255±0.095 1.473±0.017 1.607±0.043 1.728±0.018 1.622±0.019 1.490±0.041副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei 0.819±0.085 0.839±0.018 0.858±0.064 0.901±0.162 0.973±0.048 1.107±0.017 1.232±0.021 1.388±0.101 1.485±0.028 1.574±0.009 1.433±0.068 1.299±0.023 1.337±0.176乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcus lactis subsp.0.819±0.082 0.845±0.012 0.918±0.054 1.002±0.056 1.119±0.027 1.242±0.018 1.381±0.068 1.521±0.019 1.499±0.071 1.273±0.107 1.365±0.054 1.272±0.107 1.259±0.008

2.2 保加利亞乳桿菌L2紫外誘變時間的選擇

由于不同菌種對紫外線敏感程度不同，本試驗根據保加利亞乳桿菌L2的致死率和正突變率來確定最佳紫外照射時間，結果如圖1所示。

圖1 紫外線照射時間對保加利亞乳桿菌L2致死率與正突變率的影響Fig.1 Effect of UV irradiation time on death rate and positive mutative rate of Lactobacillus bulgaricus L2

夏江、馬燕等研究認為，進行菌株誘變時，一般先選取菌株致死率在70%～95%之間所對應的誘變時間，然后觀察其正突變率，正突變率最大值對應的誘變時間即為紫外線最佳照射時間[11－12]。由圖1可以看出，保加利亞乳桿菌L2的致死率隨著紫外照射時間的增加而逐漸增加，致死率在70%～95%之間所對應的誘變時間為30～60 s。照射時間在50 s時，保加利亞乳桿菌L2的致死率為87%，其正突變率達到最大值，為66.67%，因此，確定紫外最佳照射時間為50 s。

2.3 保加利亞乳桿菌L2紫外誘變的抗性初篩、復篩、二次復篩及遺傳穩定性

將保加利亞乳桿菌L2用紫外線處理50 s后，稀釋涂布于含GABA的改良MRS平板上，培養48 h，進行抗性初篩。挑取長勢較好的30個單菌落接入含有1%L－谷氨酸的改良MRS培養基中發酵進行復篩，獲得正突變菌株20株，正突變率為66.67%，正突變菌株的GABA產量見表2。

由表2可知，有三株突變菌株的GABA產量相對較高，取名為L2－4、L2－7和L2－22，在含有1%L－谷氨酸的改良MRS培養基中GABA產量分別為4.235、3.921和4.108 g·L－1，比原菌種分別提高了25.63%、16.32%、21.86%。

將L2－4、L2－7和L2－22三株高產GABA正突變菌株接入豆漿中發酵，每隔1 h測定GABA含量，結果見表3。

表2 紫外誘變后得到的正突變菌株(ˉ±S)Table 2 Strains of positive mutation by UV mutation

表2 紫外誘變后得到的正突變菌株(ˉ±S)Table 2 Strains of positive mutation by UV mutation

原菌株和正突變菌株Strain and positive mutative strain L2 L2－2 L2－4 L2－5 L2－7 L2－8 L2－9 L2－11 L2－12 L2－14 L2－15 L2－16 L2－17 L2－18 L2－20 L2－22 L2－24 L2－25 L2－26 L2－27 L2－30 GABA產量（g·L－1）Yield 3.371±0.019 3.526±0.110 4.235±0.043 3.802±0.008 3.921±0.029 3.677±0.205 3.522±0.074 3.618±0.021 3.467±0.253 3.545±0.189 3.555±0.005 3.765±0.052 3.492±0.011 3.564±0.072 3.518±0.015 4.108±0.004 3.665±0.012 3.478±0.085 3.713±0.124 3.648±0.077 3.752±0.067

表3 正突變菌株在發酵豆漿過程中GABA積累量隨時間變化情況(ˉ±S)Table 3 GABA accumulation along with the change of fermentation time by strains of positive mutation during soya bean milk fermented (g·L-1)

表3 正突變菌株在發酵豆漿過程中GABA積累量隨時間變化情況(ˉ±S)Table 3 GABA accumulation along with the change of fermentation time by strains of positive mutation during soya bean milk fermented (g·L-1)

發酵時間（h）Time菌株名稱Strain name 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 L2－4 0.819±0.012 0.853±0.052 0.918±0.007 0.975±0.034 1.172±0.032 1.298±0.071 1.427±0.023 1.579±0.013 1.748±0.018 2.213±0.026 1.739±0.045 1.794±0.205 1.721±0.045 L2－7 0.819±0.025 0.844±0.027 0.871±0.021 0.913±0.079 1.089±0.002 1.255±0.017 1.466±0.004 1.762±0.018 1.921±0.082 1.585±0.045 1.649±0.082 1.409±0.098 1.312±0.074 L2－22 0.819±0.019 0.853±0.035 0.909±0.052 0.962±0.047 1.138±0.050 1.241±0.096 1.388±0.037 1.553±0.059 1.792±0.055 2.062±0.021 1.801±0.019 1.757±0.044 1.643±0.031

通過表3可以發現，L2－7發酵到8 h時，產量達到最大值，為1.102 g·L－1；而L2－4和L2－22發酵到9 h時，產量達到最大值，分別為1.394和1.243 g·L－1。3株突變菌株比原菌株的GABA產量分別提高了3.4%、30.77%和16.6%。因此，選取L2－4和L2－22兩株突變菌株進行遺傳穩定性試驗，圖2為L2－4和L2－22在傳代12次后，每三代的GABA產量變化情況。

由圖2所示，突變菌株L2－4在連續傳代12次后，GABA產量比較穩定，而突變菌株L2－22的GABA產量明顯下降，說明L2－4比L2－22有更穩定的產GABA能力。

圖2 紫外誘變篩選的突變菌株產GABA遺傳穩定性Fig.2 Genetic stability of mutant strains producing GABA by UV mutation

綜上所述，通過紫外誘變獲得了穩定的高產GABA突變菌株L2－4，其在1%L－谷氨酸的改良MRS培養基和豆漿中GABA產量分別為4.235和1.394 g·L－1，比原菌株的GABA 產量分別提高了25.63%和30.77%。在相同的試驗條件下，對高產GABA突變菌株L2－4的GABA產量進行驗證試驗，試驗結果與該結果相同。

3 結論

a.以豆漿為發酵基質，通過比色法測定豆漿中GABA含量，對6株乳酸菌進行篩選結果表明：保加利亞乳桿菌L2為高產GABA乳酸菌菌株，GABA產量為1.066 g·L－1。

b.對保加利亞乳桿菌L2進行紫外誘變處理，結果表明，最佳紫外線照射時間為50 s。

c.在最佳紫外照射時間下，篩選出一株穩定的高產GABA突變乳酸菌菌株L2－4，其在含有1%L－谷氨酸的改良MRS培養基中的GABA產量為4.235 g·L－1，比原菌株的GABA產量提高了25.63%；同時，L2－4在豆漿中的GABA產量為1.394 g·L－1，比原菌株的產量提高了30.77%。

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