H+-ATPase弱化菌株的篩選及其應激性研究

霍貴成，崔 蘭，劉 飛,3

（1.乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；3.丹尼斯克（中國）有限公司，江蘇 昆山 215300）

隨著酸奶品種與營養價值的不斷增加，酸奶保質期短的問題亟待解決[1]。酸奶是含益生菌的乳制品，正常發酵結束后，在產品貯存、運輸、銷售、食用前這一過程中發生后酸化現象時會出現過酸味及感官質量下降，影響酸奶保質期[2]。德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）具有很強的產酸能力和耐酸性，當外界pH降低時，胞內pH也在降低，德氏乳桿菌保加利亞亞種細胞質膜中的質子泵（H+－ATPase）能夠通過將胞內質子泵出胞外來提高胞內的pH，形成跨膜的pH梯度差，從而使代謝酶的活力不受影響，使其在低pH下仍然能夠生長。因此，可以通過改變H+－ATPase的活性來控制酸奶的后酸化。本文利用新霉素來篩選H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種自發突變菌株，并對其酸應激和冷應激特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：德氏乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.9201來源于乳品工業微生物菌種保藏中心（DICC）。培養基：MRS培養基和12%（W/V）脫脂乳培養基。試劑：新霉素（購自Amresco公司）；BCA蛋白質濃度測定試劑盒（購自碧云天公司）；其他化學試劑均為分析純。

主要儀器：紫外分光光度計DU－800（Beckman公司）；680型酶標儀（美國伯樂）；DHP－9272型電熱恒溫培養箱（上海－恒科技）；飛鴿離心機GL－20G－Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 H+－ATPase缺陷突變菌株的篩選

將菌株KLDS1.9201用MRS培養基活化2次，第3代在37℃下培養至對數期，取0.1 mL菌液涂布于含有300 μg·mL－1新霉素的MRS平板上，37 ℃培養72～96 h，選取單菌落接種于液體MRS培養基，37℃培養24 h，然后涂布于含有新霉素（300 μg·mL－1）的MRS平板上。37 ℃培養72 h后，選取單菌落接種于 MRS 液體培養基（300 μg·mL－1），37℃培養48 h后測定菌液的pH和600 nm下的吸光值，只有OD600nm＜0.8和pH＞4.2的突變株被用于進一步的研究，將其在含有新霉素的液體培養基中培養一代，再將此突變株置于終濃度10%的滅菌甘油中，在－80℃下保存[3]。

將親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11以3%接種量接種于MRS液體培養基中，在37℃下培養，每隔2 h測定發酵液的pH和OD600nm。

1.2.3 菌株酸耐受力的測定

將親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11接種于MRS液體培養基中，在37℃下培養10 h，分別取30 mL菌液，10 mL用于制備透性細胞，其余 20 mL菌液 6 000 r·min－1，離心 20 min后，菌泥分別分散到等體積的普通MRS液體培養基和pH 3.0的MRS液體培養基中，37℃作用3 h[4]。作用前后分別取樣，采用平板菌落計數法測定活菌數并測定H+－ATPase活力。

1.2.4 菌株冷耐受力的測定

將親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11接種于MRS液體培養基中，在37℃培養18 h，分別取20 mL菌液，10 mL用于制備透性細胞，其余10 mL菌液，6 000 r·min－1，離心20 min，收集的菌體用等體積的PBS緩沖液洗脫，6 000 r·min－1，離心20 min，重復兩次。將收集的菌體分散于10 mL脫脂乳培養基中，混勻后分裝于安培瓶中凍干。凍干前后分別取樣，采用平板菌落計數法測定活菌數并測定H+－ATPase活力。將凍干好的菌粉接種于10 mL MRS液體培養基中，37℃培養18 h后用于制作冷應激后的透性細胞。

1.2.5 透性細胞的制備

按照Mitsuharu等的方法制備透性細胞，對其中部分步驟進行了修改[4]。分別取親本菌株KLDS 1.9201和突變菌株KLDS1.9201－11的10 mL菌液在6 000 r·min－1下，離心 20 min，收集菌體，加入500 μL Tris－HCl緩沖液（75 mmol·L－1，含 10 mmol·L－1MgSO4）和50 μL甲苯，用力攪拌直至均勻，37℃靜置5 min。將菌懸液至于－80℃中冷凍2 h，取出后再置于37℃中靜置5 min，如此反復兩次后在6 000 r·min－1下，離心20 min，收集透性細胞，用400 μL Tris－HCl緩沖液懸浮透性細胞，然后將菌懸液迅速冷凍到－80℃中，貯存備用。

與案例教學相比，傳統教學有綱可循、有綱可依，只要按教學大綱開展教學，嚴格把握教學內容，就可滿足對基礎知識和技能的教學要求。案例教學則要求教師根據不同專業的特點，自行設計教學案例，其方式與內容均不固定，不單一。這既是案例教學的魅力和特征所在，也在客觀上加大了教學的難度和不確定性。因此，教師授課過程中應嚴格、負責地把控課堂教學關，切實保障課堂教學質量，讓學生從具體案例中學有所得。

1.2.6 H+－ATPase酶活力的測定

依照 Belli和 Ongol等的方法[5－6]測定酶活，并對其中部分進行了改進。在未添加Na2ATP時，將反應混和液（3 mL）在37℃下溫育20 min，然后加入Na2ATP起始反應。在37℃下繼續溫育10 min后，加入300 μL 0.1 mol·L－1HCl終止反應，隨即將反應混合液在冰浴中冷卻，將冷卻后的反應混合液在室溫下以5 000 r·min－1離心10 min，留上清液。然后加入2.1 mL著色劑溶液（300 μL 2.5 mol·L－1H2SO4；300 mol·L－1l 2.5%（W/V）鉬酸銨；300 μL 3%（W/V）NaHSO3和1%（W/V）p－甲基氨基苯酚硫酸鹽；1.2 mL去離子水），混合后在37℃下溫育30 min，隨后立即測定OD660nm，將反應混合液中的酶粗提取物替換為 100 μL的50 mmol·L－1Tris－HCl緩沖液（pH 7.0）作為空白。用標準曲線查得或用回歸方程式求得試樣分解液的含磷量。細胞膜粗提取物中蛋白質的定量采用碧云天的BCA蛋白質濃度測定試劑盒，按照試劑盒的說明書進行操作。H+－ATPase酶的活性用U·mg－1蛋白質來表示，其中每個活力單位定義為1 mg H+－ATPase粗提取物在1 min內分解ATP形成1 μmol的無機磷酸鹽[3]。

2 結果與分析

2.1 H+-ATPase缺陷突變菌株的篩選

在本試驗中，利用新霉素來篩選質膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變菌株。在挑取了200個菌落后，篩選得到1株H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變菌株。命名為KLDS1.9201－11，它的OD600nm和pH分別為0.7647和4.60。新霉素的攝入是一個耗能的過程[7]，質膜H+－ATPase活力高的細菌能夠產生足夠的能量來攝入新霉素，從而新霉素就可以與30S核糖體亞基結合，抑制細菌蛋白質的合成，也就抑制了細菌在平板上的生長。而質膜H+－ATPase活力差的細菌不能產生足夠的能量來攝入新霉素，即具有新霉素抗性，因此可以在含有新霉素的MRS平板上生長。

2.2 親本菌株與突變菌株的生長曲線

將親本菌株KLDS1.9201與突變菌株KLDS 1.9201－11接種于MRS液體培養基中，在37℃下培養，每隔2 h測定發酵液OD600nm和pH，直至24 h為止，結果如圖1、2所示。

由圖1可知，在培養24 h后，KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的吸光度OD600nm分別為1.0299和0.7024，突變菌株KLDS1.9201－11的細胞密度明顯降低。由圖2可知，在培養24 h后，KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的pH分別為4.05和4.56，突變菌株KLDS1.9201－11的產酸量較親本菌株KLDS 1.9201也明顯降低。質膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變菌株具有較低的底物磷酸化水平[3]，因此ATP的產量也隨之減少，導致了突變菌株KLDS1.9201－11的低生長速率和弱產酸能力。

圖1 KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的生長曲線Fig.1 Growth curve of KLDS 1.9201 and KLDS 1.9201-11

圖2 KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的pH變化曲線Fig.2 pH curve of KLDS 1.9201 and KLDS 1.9201-11

2.3 酸應激對菌株的生長及H+-ATPase活性的影響

2.3.1 酸應激對菌株的生長影響

親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS1.9201－11在酸應激前后的活菌數變化情況見表1。

由表1可知，親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS1.9201－11在pH 3.0的MRS液體培養基中培養3 h后，活菌數與在普通MRS液體培養基中時明顯下降。親本菌株KLDS1.9201下降了86.98%，突變菌株KLDS1.9201－11下降了99.98%，顯而易見，突變菌株比親本菌株活菌數下降明顯。

在pH 3.0的MRS液體培養基中，突變菌株比親本菌株表現出更強的酸敏感性。在酸性環境下，乳酸菌通過質膜H+－ATPase將胞內質子泵出胞外來提高胞內pH，保持胞內pH維持在中性附近，使得菌體自身的代謝正常進行，而突變菌株的質膜H+－ATPase活力較差，不能及時有效的將胞內質子泵出胞外，致使胞內pH過低，影響菌體的生長，因此親本菌株的酸耐受力比突變菌株強。

表1 酸應激對菌株活力的影響Table 1 Effects of acid stress on the strains activity

2.3.2 酸應激對H+－ATPase活性的影響

采用碧云天的BCA蛋白質濃度測定試劑盒測得的牛血清白蛋白（BSA）蛋白標準曲線見圖3。

圖3 蛋白標準曲線Fig.3 Protein standard curve

由圖3可知，蛋白標準曲線的相關系數為0.9942，說明本標準曲線的線性程度較高，可作為蛋白質濃度測定的標準曲線，用于H+－ATPase活性測定過程中蛋白含量的測定。準確吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL磷標準溶液于100 mL容量瓶中，用超純水定容。隨后按照1.2.6的方法制作磷標準曲線，結果見圖4。在無機磷酸鹽濃度為0～0.27 mmol·L－1的范圍內，相關系數為0.9982，說明本標準曲線的線性程度較高，可作為無機磷酸鹽濃度測定的標準曲線，用于H+－ATPase活性測定過程中無機磷酸鹽含量的定量。

親本和突變菌株酸應激前后的酶活變化結果見表2。由表2可知，突變菌株的質膜H+－ATPase活性明顯比親本菌株低，而且在3 h的pH 3.0的酸應激后，酶活都有了明顯下降，親本菌株KLDS1.9201下降了13.33%，突變菌株KLDS 1.9201－11下降了21.15%，說明突變菌株具有更強的酸敏感性。

圖4 磷濃度標準曲線Fig.4 Protein standard curve

表2 酸應激對H+-ATPase酶活的影響Table 2 Effects of acid stress on the H+-ATPase activity

在酸奶的后酸化過程中，當pH下降時，質膜H+－ATPase弱化的突變菌株比親本菌株表現出較弱的代謝水平，使產酸水平下降[8]，從而使酸奶的后酸化速率降低，這對弱后酸化酸奶發酵劑的開發具有重要意義。

2.4 冷應激對菌株的生長及H+-ATPase活性的影響

2.4.1 凍干對菌株的生長影響

親本菌株KLDS1.9201和突變菌株KLDS 1.9201－11在凍干前后的活菌數變化情況見表3。

凍干是菌種保存的重要手段，可以使菌種的活力得到保證[9]。通過本研究的結果發現，親本菌株在凍干后活菌數下降了76.71%，而突變菌株只下降了4.88%。在凍干過程中，細菌活性的下降可能主要由以下兩個因素引起，一是在預凍時，由于細胞內的水分形成冰晶造成細胞膜損傷而導致部分細胞死亡[10]；二是在凍干過程中，部分細菌可能會由于嚴重缺水引起蛋白質和細胞內代謝相關酶類的變性而死亡[11]。不同屬的細菌對凍干的抵抗力不同，同一屬的不同菌種，同種的不同菌株也會表現出對凍干的不同抗性[12]，由此可以得出結論，突變菌株的冷適應性比親本菌株強。

表3 冷應激對菌株活力的影響Table 3 Effects of cold stress on the strains activity

2.4.2 凍干對H+－ATPase活性的影響

親本和突變菌株凍干前后的H+－ATPase酶活見表4。

表4 凍干對質膜H+-ATPase酶活的影響Table 4 Effects of cold stress on the H+-ATPase activity

親本菌株凍干后的酶活力下降了4.27%，由凍干前后親本和突變菌株的活菌數變化可知，凍干對菌體是有損傷的，其中對親本菌株的損傷較大，凍干后活菌數下降了76.71%，所以有可能導致其H+－ATPase酶被破壞，從而導致其活力的降低。然而突變菌株的H+－ATPase酶活卻上升了29.71%，這可能是由于凍干對突變菌株的傷害作用并不大，突變菌株的活菌數在凍干后僅下降了4.88%就是證明。另外，突變菌株H+－ATPase酶活的增加可能是由于冷應激導致其大量表達，仍需進一步研究。

3 討論與結論

本研究篩選出一株質膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種自發突變株，命名為KLDS1.9201－11，以3%接種量，37℃培養24 h后，與親本菌株KLDS1.9201相比其生長速率較慢，且產酸能力差。在經過pH 3.0的酸應激3 h后，親本菌株和突變菌株的活菌數分別減少了86.98%和99.98%，H+－ATPase活性分別降低了13.33%和21.15%，突變菌株表現出更強的酸敏感性，這有利于弱后酸化酸奶發酵劑的制作。在凍干后，親本菌株和突變菌株的活菌數分別減少了76.71%和4.88%，親本菌株的H+－ATPase活性降低了4.27%，突變菌株的H+－ATPase活性上升了29.71%，說明突變菌株的冷適應性比親本菌株好，有利于直投式發酵劑的制作過程中活菌數的提高。因此，質膜H+－ATPase缺陷的德氏乳桿菌保加利亞亞種自發突變菌株KLDS1.9201－11能夠使酸奶的后酸化速率降低，酸奶的保質期能夠延長，可用于弱后酸化直投式酸奶發酵劑的研制。

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