著絲粒特異組蛋白CENH3的研究及應用

周淑芬

（福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，福建 福州 350003）

著絲粒由DNA和蛋白質(zhì)組成，是真核生物有絲分裂和減數(shù)分裂過程中染色體正確分離和傳遞所必需的染色體區(qū)域。雖然著絲粒的功能非常保守，但真核生物各物種的著絲粒DNA序列卻是高度變異的。相比之下，著絲粒蛋白在物種間則相對比較保守。根據(jù)它們在細胞周期中與著絲粒的關系，可將著絲粒蛋白分為兩種，即只在有絲分裂過程中短暫出現(xiàn)的兼性蛋白和在整個細胞周期都存在的基本蛋白。著絲粒特異組蛋 H3（centromere－specific histone H3，CENH3）是較早被發(fā)現(xiàn)的一種基本蛋白，是功能著絲粒染色質(zhì)最基本的特征，在著絲粒染色質(zhì)的識別和保持中起著關鍵作用，對其進行研究具有重要意義。本文主要圍繞CENH3的發(fā)現(xiàn)及進化、結構與功能及應用等展開綜述。

1 CENH3的發(fā)現(xiàn)及進化

CENH3是一個著絲粒特異的組蛋白H3突變體，只存在于真核生物的功能著絲粒中［1－2］。自從在人類的活性著絲粒中鑒定了第一個CENH3——CENP－A以來［3］，相繼在芽殖酵母、秀麗桿線蟲、鼠、果蠅、裂殖酵母等生物獲得了CENP－A的同源物［4］。最近，又鑒別了玉米、擬南芥、水稻、甘蔗等植物的CENH3［5－8］。在玉米和擬南芥中，進一步通過CENH3抗體進行免疫染色，結果表明CENH3存在于整個細胞周期的著絲粒中。

與組蛋白H3相比，CENH3在進化上則是快速的，在不同物種甚至是同一物種的不同亞種之間的CENH3都會出現(xiàn)一定程度的適應性進化。NAGAKI等［1］對擬南芥、煙草、水稻和地楊梅等四種植物的CENH3進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)它們的N端區(qū)域具有多樣性。對水稻不品種的CENH3基因及轉錄本進行，發(fā)現(xiàn)它們具有血統(tǒng)特異的適應性進化［9］。CENH3的這種適應性進化現(xiàn)象可能與快速進化的著絲粒衛(wèi)星DNA有關。

2 CENH3的結構與功能

CENH3包含氨基端（氨基末端尾巴）和羧基端（組蛋白質(zhì)折疊域，HFD）兩個結構域。氨基末端尾巴是生存所必需的，其長度和序列高度可變，可能與其他著絲粒蛋白相互作用有關［10］。相比之下，組蛋白質(zhì)折疊域（HFD）則比較保守，包括了4個α螺旋（αN、α1、α2、α3）和2個環(huán)（Loop1和Loop2）。同源比對分析發(fā)現(xiàn)，人類CENP－A與哺乳類動物CENH3的組蛋白折疊域具有60%同源性。相對于組蛋白折疊域的其他結構，α1、α2螺旋及Loop1環(huán)顯得更具有多樣性，可能與CENH3的DNA結合專一性密切相關。在人類中發(fā)現(xiàn)CENP－A－H4比H3－H4四聚體結構更緊湊、更剛硬［11］，導致這種差異的區(qū)域包括組蛋白折疊域的Loop1環(huán)。在果蠅和擬南芥中還發(fā)現(xiàn)，CENH3的Loop1環(huán)及核心序列的一個鄰近區(qū)發(fā)生了適應性進化［6，12］，而且果蠅的Loop1環(huán)是其CID（CENH3）在著絲粒定位的必要和充分條件。

CENH3存在于真核生物活性著絲粒的核小體中，取代了核小體組蛋白八聚體中的組蛋白H3［13］，是著絲粒形成的早期標志。CENH3可募集其他著絲粒蛋白并與它們形成復合體，決定著絲粒的組裝及染色體的正常分離與傳遞。在果蠅和老鼠中的實驗發(fā)現(xiàn)，當破壞CENH3時，所有被檢測的著絲點蛋白都被錯誤定位［14］。GOSHIMA等［15］應用RNAi方法敲減人類CENP－A基因，發(fā)現(xiàn)染色體分離發(fā)生錯分。說明CENH3對著絲粒的組裝和功能的正常發(fā)揮至關重要。

3 CENH3的應用

CENH3是功能著絲粒的共同基礎，可作為功能著絲粒染色質(zhì)的識別標記，目前利用該蛋白進行生物學研究主要包括以下幾個方面。

3.1 功能著絲粒的邊界和大小的確定

由于CENH3是功能著絲粒的一個基本組分，因此可通過CENH3抗體的染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，CHIP）實驗，鑒別與CENH3相互作用的DNA序列，進而確定功能著絲粒的邊界和大小。實驗研究表明，與CENH3相連的著絲粒染色質(zhì)只包含一小部分衛(wèi)星DNA［7，16］。在栽培稻第8號染色體的著絲粒（CEN8）中，與CENH3結合的衛(wèi)星DNA（CentO）約750kb，即其功能著絲粒的大小約為750 kb。玉米A染色體著絲粒中與CENH3結合區(qū)域為含有300～700kb的混合CentC和CRM重復序列，玉米B染色體的CENH3結合區(qū)為700kb，因此玉米染色體中的功能著絲粒大小約300～700 kb。

3.2 功能著絲粒DNA序列的鑒定

通過用CENH3抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）實驗，可以確定所檢測的DNA序列是否屬于著絲粒的功能DNA元件；同時對與CENH3抗體發(fā)生免疫沉淀的染色質(zhì)進行克隆與分析，可獲得功能著絲粒DNA序列。擬南芥、玉米、水稻和甘蔗等植物中通過CHIP實驗表明，它們的衛(wèi)星DNA和反轉錄轉座子元件（CRR）能被CENH3的抗體沉淀，即與CENH3發(fā)生相互作用，說明了衛(wèi)星DNA和反轉錄轉座子元件CRR是這些物種著絲粒的功能組分［17］。

3.3 利用改造的CENH3介導染色體消除獲得單倍個體

此方法目前在擬南芥中得到證實，RAVI等［18］通過對編碼擬南芥著絲粒特異組蛋白CENH3的基因進行改造，利用轉基因技術將其導入cenh3擬南芥突變體中獲得只表達人工改造CENH3基因的轉基因植株，以此為母本與野生型父本的雜交后代中會出現(xiàn)最高誘導率達45%的單倍體植株，有趣的是獲得的單倍體植株基因組中只含有來自父本的野生型基因組，而來自母本的含有人工改造CENH3的染色體組被從合子中剔除。采用同樣的方法，與四倍體擬南芥雜交，也成功獲得了倍性減半的二倍體植株。該方法將基因工程技術與常規(guī)的雜交育種手段相結合，達到改變?nèi)旧w倍性的目的，為研究單倍體的形成機制提供很好的依據(jù)，同時該方法也是一種利用轉基因技術生產(chǎn)非轉基因植物的良好策略。由于CENH3普遍存在于真核生物中，因此這種方法可以推廣到其他物種單倍體誘導中。

4 問題與展望

目前對CENH3的結構和功能已有了一定的了解，但它如何影響著絲粒的形成、著絲粒功能的正確行使、與其他著絲粒蛋白的相互作用尚不清楚，非整倍體的成因仍有待于進一步探究。核心組蛋白的翻譯后修飾決定著基因組中染色質(zhì)的不同狀態(tài)，在人類和果蠅的著絲粒組蛋白CENH3中發(fā)現(xiàn)具有獨特的修飾組合，但在栽培稻的著絲粒組蛋白CENH3不具有獨特的修飾組合，進一步解析著絲粒染色質(zhì)的組蛋白修飾，對于認識著絲粒染色質(zhì)的特征及其與著絲粒功能的關系將會有很大幫助。近幾年來，RNA干擾技術的應用及人工染色體的成功構建，對著絲粒蛋白的研究更為便利和精確。

［1］NAGAKI K，TERADA K，WAKIMOTO M，et al.Centromere targeting of alien CENH3sin Arabidopsis and tobacco cells ［J］.Chromosome Research，2010（18）：203–211.

［2］SULLIVAN BA，BLOWER MD，KARPEN GH.Determining centromere identity：cyclical stories and forking paths ［J］.Nature Rev Genet，2001，2（8）：584－596.

［3］PALMER DK，O’DAY K，WENER MH，et al.A 17－kD centromere protein（CENP－A）copurifies with nucleosome core particles and with histones ［J］.J Cell Biol，1987，104（4）：805－815.

［4］余朝文，宋運淳 .植物著絲粒結構和功能的研究進展 ［J］.遺傳，2006，28（12）：1597－1606.

［5］ZhONG CX，MARSHALL JB，TOPP C，et al.Centromeric retroelements and satellites interact with maize kinetochore protein CENH3 ［J］.Plant Cell，2002，14（11）：2825－2836.

［6］TALBERT PB，MASUELLI R，TYAGI AP，et al.Centromeric localization and adaptive evolution of an Arabidopsis histone H3variant［J］.Plant Cell，2002，14（5）：1053－1066.

［7］NAGAKI K，ChENG Z，OUYANG S，et al.Sequencing of a rice centromere uncovers active genes ［J］.Nature Genet，2004，36（2）：138－145.

［8］NAGAKI K，Murata M.Characterization of CENH3and centromere－associated DNA sequences in sugarcane ［J］.Chromosome Res，2005，13（2）：195－203.

［9］HIRSCH CD，WU Y，YAN H ，et al.Lineage－Specific Adaptive Evolution of the Centromeric Protein CENH3in Diploid and Allotetraploid Oryza Species ［J］.Mol Biol Evol，2009，26（12）：2877–2885.

［10］HENIKOFF S，AHMAD K，MALIK HS.The centromere paradox：stable inheritance with rapidly evolving DNA ［J］.Science，2001，293（5532）：1098－1102.

［11］BLACK BE，F(xiàn)OLTZ DR，CHAKRAVARTHY S，et al.Structural determinants for generating centromeric chromatin［J］.Nature，2004，430（6999）：578－582.

［12］MALIK HS，VERMAAK D，HENIKOFF S.Recurrent evolution of DNA binding motifs in the Drosophila centromeric histone［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（3）：1449－1454.

［13］YODA K，ANDO S，MORISHITA S，et al.Human centromere protein A（CENP－A）can replace histone H3in nucleosome reconstitutioninvitro［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（13）：7266－7271.

［14］BLOWER MD，KARPEN GH.The role of Drosophila CID in kinetochore formation，cell－cycle progression and heterochromatin interactions［J］.Nat Cell Biol，2001，3（8）：730－739.

［15］GOSHIMA G，KIYOMITSU T，YODA K，et a1.Human centromere chromatin protein hMisl2，essential for equal segregation，is independent of CENP－A loading pathway ［J］.J Cell Biol，2003（160）：25－39.

［16］JIN WW，MELO JR，NAGAKI K，et al.Maize centromeres：organization and functional adaptation in the genetic background of oat［J］.Plant Cell，2004，16（3）：57l－581.

［17］NAGAKI K，TALBERT PB，ZhONG CX，et al.Chromatin immunoprecipitation reveals that the 180bp satellite repeat is the key functional DNA element of Arabidopsis thaliana centromeres［J］.Genetics，2003，163（3）：l221－1225.

［18］RAVI M，CHAN SW.Haploid plants produced by centromere－mediated genome elimination ［J］.Nature，2010，464（7288）：615－618.