人巨細胞病毒感染人源細胞后的蛋白質檢測

楊海青，朱劍梅，邱發麒，鄧成蓮，何英，游傳蓉

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院城東病區內一科，四川 成都 610101)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬皰疹病毒科，是一種常見的機會性感染病原體，在成人中的感染率可達90%，其中絕大部分為“健康帶毒狀態”，即血清中可檢測到抗HCMV-IgG陽性，但無相關病毒疾病癥狀出現［1］。初始感染后，病毒基因組進入單核細胞并潛伏。免疫機能低下的狀態時，如獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和器官移植后使用免疫抑制劑的患者，HCMV可再次活化并導致嚴重的CMV疾病。

HCMV在體內可感染多種細胞，包括成纖維細胞、內皮/上皮細胞、平滑肌細胞、單核/巨噬細胞、中性粒細胞，但只能在少數細胞內成功復制并產生有感染力的病毒，包括單核/巨噬細胞、成纖維細胞及內皮細胞［2］。感染過程是衣殼蛋白參與病毒與細胞膜的融合，使病毒核衣殼進入胞漿，DNA-蛋白質復合物進入核孔［3］。正常狀態下，病毒基因組整合于細胞基因組內并隨細胞DNA復制，形成長期潛伏感染狀態。在免疫低下狀態時，病毒DNA復制并在細胞內裝配成成熟的病毒顆粒，通過內質網運輸到細胞表面，釋放到細胞外。在HCMV感染宿主細胞中，衣殼蛋白B(glycoproteinB，gB)起重要作用，可與細胞膜融合，并與衣殼蛋白gH、gL形成三聚體，還與細胞膜表面手體(整聯蛋白α2β1、α6β1和αVβ3)結合，完成感染［4］。

本研究選用人間充質干細胞(human marrow stromal cell，HMSC)、人胚成肌細胞(humanembryomyoblasts，HEM)、人皮膚成纖維細胞(human demal fibroblasts，HDF)，檢測其對HCMV的易感性，并通過Western-blot的方法檢測感染后蛋白質的表達情況。

1 材料與方法

1.1 病毒珠及細胞培養 HCMV病毒珠購自ATCC(VR-807)。所使用的人源細胞為 HMSC、HEM、HDF，用DMEM培養基培養(含10%新生小牛血清、2 mM谷維酸、1 mM丙酮酸鈉、100 U/ml青霉素及鏈霉素)，所有細胞2～3天換液一次。

1.2 HCMV感染靶細胞 HCMV病毒上清由MRC-5細胞產生。為去除細胞碎片，將上清離心(3000 rbm，30 min)，將HMSC、HEM和HDF按1× 106/瓶接種;第二天接病毒上清接種細胞，感染2小時后用無血清DMEM洗細胞兩次，加入完全培養基培養。

1.3 蛋白質提取 在感染后3、7、10天收集感染后的細胞及對照細胞，計數后離心(1500 rpm，5 min);用PBS洗細胞一次(1500 rpm，5 min);將離心后的細胞放置冰上，并配置蛋白質裂解緩沖液(500 μl RIPA，0.5 μl PMSF和1/2片蛋白酶抑制劑)，并混勻;按10 μl/L million加入裂解緩沖液，渦旋混均后放置冰上15 min，且每5 min渦旋混均一次;離心沉淀(14000 rpm，15 prm，4℃);收集上清并用牛血清白蛋白測定蛋白質濃度后儲存-80℃。

1.4 蛋白質印跡

1.4.1 電泳 將一次性SDS-PAGE凝膠放于電泳槽中;每孔加入20 μg提取的蛋白質，加入4 μl 4×l aemmli緩沖液，并用RIPA緩沖液補齊體積至20 μl;100℃或沸水浴加熱3～5分鐘，以充分變性蛋白。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分量分子量大小，還加入預染蛋白質分子量標準(Marker);用1×Tris-glycine-SDS電泳液加滿電泳槽后電泳(80 V，2.5 h)。

1.4.2 轉膜 將準備好的醋酸纖維素膜預先浸泡于轉膜緩沖液中(包括100 ml 10×TBS緩沖液，200 ml甲醇，700 ml水);將電泳好的凝膠放于醋酸纖維素膜上后有轉膜(300 mA，2 h);轉膜完成后用麗春紅或考馬斯亮藍染色，以觀察轉膜效果。

1.4.3 封閉 轉膜完成后，加入100 ml TBST封閉液(含5%脫脂奶粉和1%牛血清白蛋白)，4℃震蕩過夜。

1.4.4 抗體孵育 封閉完成后，用蛋白質洗滌緩沖液1×TBST(含5%Tween-20)洗3次(5 min/次)后加入用封閉緩沖液的一抗(鼠抗人CMVpp65單克隆抗體，Millipore，5097R);4℃震蕩過夜。用100 ml蛋白質洗滌緩沖液1×TBST(含5%Tween-20)洗膜5次，5 min/次;按1︰2000加入二抗(辣根過氧化物酶標免抗鼠IgG)，室溫震蕩1 h;100 ml洗滌緩沖液洗膜5次，5 min/次。

1.4.5 顯色 用ECL化學發光試劑盒，將試劑1和2按1︰1混合，室溫下顯色5 min后進入暗室曝光(曝光時間分別為:30 s和1、2、3、5 min，以尋找最佳曝光時間)。

2 結果

HCMV感染人源靶細胞3天后，已可以檢測到CMV特異性蛋白質。在HEM的檢測中，觀察到在感染后第3、7、10及14天，CMV-pp65的表達是沒有變化的(圖1)。人胚軟骨的檢測中，感染后第3天可檢測到較強的CMV蛋白質表達;但在感染后第7天，發現CMV表達已下降到無法檢測到的水平;感染后第10天和第14天，又重新檢測到CMV-PP65高表達，并且表達強度超過第3天，表明在感染后兩周，CMV在人胚軟骨中的表達更高(圖2)。在HMSC的感染檢測中，發現在感染后第7、10、14天的CMV-pp65蛋白質表達水平相當，而且均高于感染后的第3天，同時發現出現另外一條蛋白質帶，其原因可能是由于抗體的非特異結合，或者該細胞在表達中表現另外一個CMV-PP65蛋白質亞型，具體原因需通過進一步實驗室驗證。

本實驗中，為避免蛋白質總量不一致所造成的誤差，特采用β-actin為內參照，結果表明所加入的蛋白質無顯著差異。

圖1 CMV感染人胚成肌細胞后的蛋白質表達檢測N-陰性對照(未感染的人胚成肌細胞)

圖2 CMV感染人胚軟骨細胞后的蛋白質表達檢測N-陰性對照(未感染的人胚軟骨細胞)

圖3 CMV感染人間充質干細胞后的蛋白質表達檢測N-陰性對照(未感染的人間充質干細胞)

3 討論

迄今為止對人類健康造成危害的病原體中，HCMV感染占重要地位。CMV具有典型的皰疹病毒形態，其DNA結構也與HSV相似，但比HSV大5%［5］。CMV對宿主或培養細胞有高度的種特異性。HCMV可用人胚肌皮、肺、睪丸等的成纖維細胞分離或培養細胞。一般認為只有分化細胞才是CMV的容許細胞，未分化或者轉化細胞是非容許細胞，在非容許細胞中，病毒基因不表達［6］。

HCMV初始感染宿主后，病毒基因組進入單核細胞并潛伏。應用敏感的PCR技術可在健康攜帶者的外周血單核細胞中檢測到病毒DNA，提示單核細胞為病毒持續存在的位點之一。HCMV與單核細胞、巨噬細胞和組織細胞的相互作用可能是引起病毒持續和潛伏感染的主要原因(醫學分子病毒學)。近年大量的實驗結果證實，HCMV的致病機理為誘細胞周期蛋白和細胞周期相關激酶的高水平表達，刺激細胞的有絲分裂，從而誘導原癌基因的表達或表達增高，以這種方式干擾細胞的調控機制尤其是干擾細胞增生、分化的調控，使細胞惡性變;同時HCMV感染的細胞中，腫瘤抑制蛋白p53蓄積增加，HCMV IE2能與其結合并抑制報告基因的轉錄，IE2蛋白還能結合另一個與細胞周期調控有關的腫瘤抑制蛋白PRB，因此HCMV感染既損傷了抗癌基因產物的功能，又刺激了原癌基因的過度表達，直接參與了細胞的惡性變過程［7，8］。

在本研究采用三種未轉化的人源原代細胞，包括HMSC、HEM和人胚軟骨細胞，研究CMV是否會感染這三種原代細胞，以及感染后不同時間病毒蛋白質的表達情況，結果發現CMV可成功感染這3種原代細胞，并在感染后不同時間段均表達病毒蛋白，表明CMV在這3種細胞中處于活化狀態。但CMV對這3種細胞的致病情況仍待研究。

［1］Wei Wang，Ping Yu，Peng Zhang，et al.The infection of human primary cells and cell lines by human cytomegalovirus:new tropism and new reservoirs for HCMV［J］.Virus research，2008，131:160-169.

［2］Revello MG，Gerna G.Human cytomegalovirus tropism for endothelian/epithelian cells:scientific background and clinical implications［J］.Rev Virol，2010，20:136-155.

［3］Vanarsdall AL，Ryckman BJ，Chase MC，et al.Human cytomegalovirus glycoprotein gB and gH/gl mediate epithelial cell-cell fusion when expressed either in cir or in trans［J］.J Virol，2008，82(23):11837-11850.

［4］Feire AL，Koss H，Compton T.Cellular integrins function as entry receotor for human cytomegalovirus via a highly conserved disintegrinlike domain.Proc.Nat.Acad［J］.Sci，2004，101:15470-15475.

［5］金奇.醫學分子病毒學［M］.北京:科學出版社，2001.

［6］Michaelis M，Doerr HW，Jindrich CJ.Oncomodulation by human cytomegalovirus:evidence becomes stronger［J］.Med.Microbiol［J］.Immunol，2009，198:79-81.

［7］Cobbs CS，Soroceanu L，Denham D，et al.Human cytomegalovirus induces cellular tyrosine kinase signaling and promotes glioma cell invasiveness［J］.J Neurooncol，2008，85:271-280.

［8］Tabata T，Kawakatsu H，Maidji E，et al.Induction of an epithelial integrin alphaveta6 in human cytomegalovirus-infected endothelial cells leads to activation of transforming growth factor-beta 1 and increased collagen production［J］.Am J Pathol，2008，172:1127-1140.