藍莓汁生產熱燙工藝對多酚氧化酶及多酚類化合物的影響

楊秀松

（國家食品藥品監督管理局 高級研修學院，北京 100073）

藍莓屬于漿果類，營養豐富，其果實除含有糖、酸和Vc外，還富含維生素E、胡蘿卜素、以及豐富的K、Fe、Zn、Mn等微量元素。據測定，每100g藍莓含蛋白質0.5g，脂肪0.1g，碳水化合物12.9g，Ca 8mg，Fe0.2mg，P9mg，K70mg，Na1mg，Zn0.26mg，Se 0.1mg，胡蘿卜素9mg，Vc 9mg，VE 1.7mg。除營養成分外，藍莓果實中還含有大量以花色甙為主的植物化學物質，具有較強的抗氧化能力。野生種花色甙色素含量高達0.33～3.38g/100g鮮果，栽培種一般為0.07～0.15g/100g鮮果。

藍莓果實含有大量的多酚氧化酶（PPO），在藍莓加工過程中多酚氧化酶與花色苷及其它酚類物質充分接觸，催化酚類物質發生氧化反應，導致果汁褐變。熱處理可鈍化PPO，防止褐變的發生，工業上常采用沸水熱燙或蒸汽熱燙。但藍莓屬于漿果，沸水熱燙造成營養成分及功能成分的流失。采用蒸汽熱燙，降低熱處理造成的抗氧化成分的損失。本文研究了熱燙條件對多酚氧化酶滅活的效果以及探討了熱燙條件對果汁抗氧化能力的影響，主要是針對藍莓汁清除超氧陰離子和羥自由基的能力。

1 材料與試劑

1.1 材料和試劑

藍莓：野生藍莓，產自大興安嶺。藍莓汁的提取是將野生藍莓經蒸汽熱燙、打漿、離心得到的上清液。1.7mg·mL-1LDL（協和生化所）。除三羥甲基氨基甲烷（Tris）為進口分裝外，其余試劑均為國產分析純或國產生化試劑。配制用水均為二次蒸鎦水。

1.2 儀器和設備

熱電偶數字顯示巡回檢測儀型號XMD（上海自動化儀表六廠）；UV2754型紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；UVIKONXL紫外分光光度計（法國SECOMAM）；超級恒溫水浴（上海市實驗儀廠）；AE-4650電泳槽（ATTO公司）；AE-8150電泳電壓裝置（ATTO公司）。

2 實驗方法

2.1 多酚氧化酶（PPO）的提取及酶活力的測定

將藍莓按1∶2的料液比加入冷凍至-25℃的丙酮打漿，迅速抽濾，殘渣用冷風吹干至無丙酮味，即得丙酮粉。丙酮粉用pH值為7.4的0.10mol·L-1的磷酸鹽緩沖液提取，冷凍離心得粗酶液。

比色皿中加入2mL pH值為4.0的NaAc緩沖液、0.01 mol·L-1的綠原酸溶液0.7mL以及0.3mL粗酶提取液，在400nm下測吸光值隨時間的變化。以每毫升粗酶反應液在前2min內吸光值隨時間的變化情況計為酶活單位（吸光值·（mL·min）-1）。多酚氧化酶酶活的計算公式：

式中 M：每秒鐘增加的吸光值；V：粗酶液的體積mL。

2.2 超氧陰離子清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化速率測定法測定，原理為鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化、釋放出超氧陰離子，生成有色的中間產物，可用分光光度法進行測定。中間產物在320nm有強烈光吸收，當有抗氧化物存在時，可清除超氧陰離子，所以可以通過測定吸光度來計算清除率從而判斷其抗氧化性。

采用鄰苯三酚自氧化速率測定法，25℃下，在4.0mLTris-HCL溶液（pH=8.2）加入 1.0mL的 3mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，迅速混勻，測定樣品管時加入1.0mL的藍莓汁，測定基底管時不加樣品而用Tris-HCL溶液定容為6mL，然后倒入石英比色杯內，在320nm波長光線下，每隔30s測吸光值A一次，得到實驗數據。

按下式計算藍莓汁對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率（S%）

式中 A空：空白試管中溶液吸光度值；A底：只有基底的試管中溶液吸光度值；A樣：加入樣品的試管中溶液吸光度值。

2.3 羥自由基清除能力的測定

清除羥自由基實驗的原理為：Fe2＋-EDTA、抗壞血酸及過H2O產生·OH使脫氧核糖降解，在酸性環境中，降解產物可與TBA反應，形成粉紅色物質，可用比色法測知脫氧核糖的降解情況，了解受試物是否具有清除·OH的能力。

實驗過程：取干凈的10mL硬質管，加入PBS緩沖液（KH2PO4-K2HPO4pH=7.4）0.4mL，再加入 0.1mL的樣品液（包括 1.04mmol·L-1EDTA-1mmol·L-1Fe-SO41mmol·L-1Vc）和 12mmol·L-1H2O20.1mL，再加入 60mmoL·L-1DR（脫氧核糖）0.05mL，然后用 PBS緩沖液定容為1.0mL。將管中液體混合均勻后置于37℃的恒溫水浴鍋中保持1h。水浴完畢取出，迅速添加1mL 10%TCA（三氯乙酸）及1mL 1%TBA（硫代巴比妥酸），在100℃沸水中加熱15min取出，冷卻。于532nm處測吸光值，得到實驗數據。

按下式計算藍莓汁對羥自由基（OH·）的清除率（S%）

式中 A模型：模型管吸光度（不加樣品）；ADR：加入清除劑和DR后的吸光度；A樣品：樣品本身的吸光度（不加DR）。

3 實驗結果

統計學處理數據用均數±標準差（X±S）表示，采用SAS9.0軟件包對各組數據進行方差分析。

3.1 熱燙對多酚氧化酶（PPO）活性的影響

熱燙的主要目的是使藍莓的內源性多酚氧化酶失活，防止果汁發生酶促褐變，因而熱燙要使藍莓的中心溫度達到一定值才能保證藍莓的PPO完全失活。通入蒸汽時間越長，中心溫度越高，酶的失活越徹底，但活性成分的損失也越嚴重，因此，本試驗設計了籠屜式與堆放式兩種熱燙方式，比較蒸汽通入時間對多酚氧化酶和抗氧化成分的影響。

設定的蒸汽通入時間為 1、2、3、4min，并以未通入蒸汽為對照。測定加入藍莓粗酶后20、40、60、80、100、120s綠原酸溶液光密度的變化，計算多酚氧化酶的活性。兩種熱燙方式在不同蒸汽通入時間下多酚氧化酶的活性見圖1、2。

圖1 籠屜式熱燙蒸汽通入時間對多酚氧化酶的滅活作用Fig.1 Effect of steaming time of streaming heating on deactivation to polyphenoloxidase

圖2 堆放式熱燙蒸汽通入時間對多酚氧化酶的滅活作用Fig.2 Effect of steaming time of stack heating on deactivation to polyphenoloxidase

由圖1、2可見，籠屜式熱燙可在2min達到對多酚氧化酶的滅活作用，堆放式熱燙則需要4min才能鈍化多酚氧化酶。結果表明，籠屜式熱燙效果好于堆放式。這和堆放式物料體積較大，中心溫度上升較慢有關。

3.2 熱燙對藍莓汁抗氧化能力的影響

超氧陰離子自由基（O2-·）是體內造成機體氧化損傷最主要的自由基，可造成蛋白質和脂質的過氧化損傷，清除超氧陰離子自由基（O2-·）的能力可反映體系的抗氧化損傷的能力。為此，分別將蒸汽通入時間為1、2、3、4min制備的藍莓汁1mL加入反應體系，測定其對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力，結果見圖3。

圖3 蒸汽通入時間對藍莓汁超氧陰離子自由基清除能力的影響Tab.3 Effect of steaming time on clean of free radical of superoxide anion

羥自由基是另一種主要自由基，對DNA的損傷作用較強。分別將蒸汽通入時間為1、2、3、4min制備的藍莓汁0.1mL加入反應體系，測定其對羥自由基（OH·）的清除能力，結果見圖4。

圖4 蒸汽通入時間對果汁羥自由基清除能力的影響Tab.4 Effect of steaming time on clean of hydroxy radical

由圖3、4可見，兩種熱燙方式下，隨蒸汽通入時間的延長，果汁對超氧陰離子自由基、羥自由基的清除能力均呈下降趨勢，其中籠屜式熱燙對自由基的清除能力的影響更大、衰減更快。但從籠屜式的滅酶時間2min和堆放式的滅酶時間4min看，籠屜式熱燙保留的抗氧化成分要多一些。上述結果表明，籠屜式熱燙比堆放式適合藍莓汁的制備。

4 結論

多酚氧化酶是一類以Cu2+為輔基的氧化還原酶，通過分子氧催化酚類物質氧化得到醌，隨后發生醌聚合而產生褐變反應。同時影響產品多酚的含量和抗氧化活性。通過加熱的方式可以滅活多酚氧化酶，防止果汁褐變。但同時加熱也可以造成多酚物質的氧化，使其抗氧化活性降低。因此抑制多酚氧化酶、保存多酚的抗氧化活性是藍莓果汁制備的關鍵質量控制目標之一。

酶與多酚的失活和加熱溫度、加熱時間呈正相關，因此，加快到達中心溫度的時間、減少溫度的維持時間，既可使多酚氧化酶失活，又可以盡可能地保留多酚的抗氧化活性。為此，本文設計了籠屜式加熱與堆放式加熱兩種熱處理方式，結果表明籠屜式熱燙處理好于堆放式熱燙。籠屜式熱燙2min可達到滅活多酚氧化酶的效果，同時可保留較多的多酚類抗氧化成分。這是因為籠屜式熱燙操作過程中物料厚度小，到達中心溫度的時間快，因而通入蒸汽2min即可起到滅酶作用，比堆放式到達滅酶時間（4min）短，因而多酚破壞少。

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