人羧酸酯酶1結構和功能的研究進展

童金英，易銀沙，曹蓬榮，劉彩云，王雷，呂媛

1 湖南師范大學醫學院，湖南長沙 410006

2 長沙贏潤生物技術有限公司，湖南長沙 410013

人羧酸酯酶(Human carboxylesterase)是絲氨酸水解酶多基因家族的重要成員之一，屬于B族酯酶。該酶與多種藥物、前體藥物、環境毒物及致癌物的解毒和代謝有關，能有效催化羧酸酯類、氨甲酸酯類、酰胺類、硫酯類等外源性物質的水解[1-2]。人羧酸酯酶主要包括人羧酸酯酶1(Human carboxylesterase 1,HCE1)和人羧酸酯酶2(Human carboxylesterase 2,HCE2)，分別由ces1和ces2基因編碼，兩者的氨基酸序列同源性為48%，在組織分布及底物特異性方面存在著較大的差異[3-5]。HCE1為肝羧酸酯酶，主要分布于肝臟，其在胃腸道含量較低；HCE2為腸羧酸酯酶，主要分布于胃腸道，特別是小腸中其含量極為豐富[6]。HCE1容易催化含較小醇基和較大酰胺基底物的水解，如哌醋甲酯(Methylphenidate)、奧司他韋(Oseltamivir)等藥物；相反，HCE2更容易催化含較大醇基和較小酰胺基底物的水解，如可卡因(Cocaine)、伊立替康(Irinotecan)等藥物[5,7]。HCE1是一種參與肝臟外源物質解毒及藥物代謝的羧酸酯酶，但HCE1除了在藥物、毒物代謝方面發揮重要作用外，還能參與人體內膽固醇酯和游離脂肪酸的運輸和代謝過程[8-9]，是肝細胞肝癌早期診斷的一種良好的血清學標志物[10-11]。文中從HCE1的結構、藥物代謝、毒物代謝、脂質代謝及肝細胞肝癌早期診斷等功能方面，綜述了近十年來HCE1的相關研究進展，為深入研究HCE1的功能，特別是藥物代謝上的性質與功能打下基礎，同時也為肝細胞肝癌的早期診斷試劑的研發提供參考。

1 HCE1結構和分布

在1993年，人ces1基因的cDNA 及全長序列是由Kroetz 等[12]和Shibata 等[13]分別首次從人肝λgt11文庫、人外周血細胞基因組DNA 文庫克隆出來的。ces1基因定位于人染色體上16q22.2，全長30313 bp，含有14個外顯子。該基因在選擇性剪切的過程中可產生3種mRNA亞型：亞型a (RefSeq ID：NM_001025195.1)、亞型 b (RefSeq ID：NM_001025194.1)和亞型c (RefSeq ID：NM_001266.4)，分別可編碼含568、567、566個氨基酸殘基的 N-連接糖蛋白(N-linked glycoprotein)，相對分子量大小約為62 kDa 。通過查詢 GeneCards 數據庫(http://www.genecards.org)和NCBI SNP 數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)發現，人ces1基因的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)記錄已有836條，其中非編碼序列區的SNPs 約占83%，另外可引起編碼區氨基酸置換的SNPs 有76個，其中較為有臨床意義的2個 SNPs 分別是 p.Gly143Glu 和p.Asp260fs[14]。p.Gly143Glu 是指ces1基因編碼序列的第4外顯子第143位的甘氨酸突變成谷氨酸(GGG→GAG)，為一種錯義突變，但其仍可以翻譯出567個氨基酸。Gly143Glu 的小等位基因突變頻率在白人、黑人、西班牙人、亞洲人群中的分布分別為3.7%、4.3%、2.0%和0.0%。p.Asp260fs 指ces1基因編碼序列的第6外顯子中第260位密碼子的最后一個核苷酸有一堿基缺失(GAT→GA-G，T/?)，可導致第260～299位氨基酸發生移碼突變，即引起后續39個氨基酸錯誤翻譯，同時可導致其翻譯過程提前終止，造成未成熟終止密碼子，僅翻譯出298個氨基酸。p.Asp260fs 在人群中的分布極為少見。

HCE1蛋白由催化中心結構域、α/β結構域、調節區結構域，其中催化中心結構域含有酶活化位點催化中心，而調節區結構域包含低親和性的配體結合部位——“Z-site”。HCE1蛋白含有羧酸酯酶家族共有特征性序列，如活化部位氨基酸殘基三聯體(Ser221、Glu354和His468)、微粒體導向序列[包括N-端疏水性信號肽序列和C-端內質網滯留序列(His-Ile-Glu-Leu，HIEL)]、2對二硫鍵形成的氨基酸殘基(Cys87/Cys116和Cys274/Cys285)、配體結合部位[包括“Z-site”(Gly356)、“side door”(Val424-Met425-Phe426)和“gate”(Phe550)]等[1]。其中，“Z-site”和“side door”分別可結合膽固醇和脂肪酸類似物，“gate”可釋放所結合的底物，N-糖基化位點(Asn79-Ala80-Thr81)在維持酶的穩定性及最大酶催化活性功能中可發揮重要作用[15]。C-端內質網滯留序列(His-Ile-Glu-Leu,HIEL)可結合到內質網內腔膜上的HIEL 受體，與HCE1在內質網內腔的滯留及酶的分泌功能有關[16]。HCE1在內質網內腔膜上的定位主要依賴于其蛋白N 端的18個疏水性氨基酸信號肽，該信號肽有助于HCE1通過內質網進入血循環進行運輸，可與β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)形成復合體，以促進第二相藥物的催化水解[16]。

HCE1是主要由肝臟組織合成和分泌的一種N-連接糖蛋白，可通過內質網和高爾基體分泌到血液循環中[17]。HCE1主要定位于肝臟微粒體和肝細胞質中，該酶在肝組織中的表達水平與年齡呈正相關，即隨著年齡的增大，其肝臟內HCE1的表達水平則越高[18]。早期的研究中發現，HCE1高表達于單核細胞/巨噬細胞、肺巨噬細胞、肺上皮細胞中[19]。另外，HCE1在腦、胃、睪丸、腎、脾、結腸等組織中亦可見少量表達[4,17]。

2 HCE1的藥物代謝功能

HCE1是一種很重要的肝藥物代謝酶[2]，該酶能有效水解含有酯鍵、酰胺鍵、硫酯鍵的外源性藥物或前體藥物，例如血管緊張素轉換酶抑制劑(替莫普利Temocapril，咪達普利Imidapril，地拉普利Delapril)、抗癌藥(伊立替康Irinotecan、卡培他濱 Capecitabine)、麻醉劑(可卡因Cocaine、海洛因Heroin、哌替啶Pethidine)等藥物[20]。HCE1可以將抗結腸癌藥物——伊立替康(Irinotecan,CPT-11)激活為藥物活性代謝產物——SN-38(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，拓撲異構酶Ⅰ抑制劑)。由于HCE1在人肝臟組織中的含量十分豐富，它可負責肝臟內50%伊立替康的代謝激活反應[21]。但目前體外研究[22]表明，伊立替康的藥物代謝激活主要依賴于HCE2的酶活性，HCE2對于伊立替康的代謝激活能力顯著高于HCE1。人體內十二指腸、空腸、回腸、腎等組織中約99%以上的伊立替康的生物轉化反應均由HCE2負責[21]。HCE1在體內血管緊張素轉換酶抑制劑藥物的代謝過程也發揮著重要作用，HCE1可將其激活為活性代謝產物。如替莫普利(Temocapril，藥物前體)可被HCE1激活，產生有活性的血管緊張素轉換酶抑制劑——替莫普利拉(Temocaprilat)[23]。Zhu 等[24]以野生型基因ces1(Wild type,WT)和2種基因突變型——p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 分別轉染Flp-In-293細胞以表達相應的酶，發現野生型酶可有效催化群多普利(Trandolapril)為活性產物——群多普利拉(Trandolaprilat)，而攜帶有p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 突變的基因可導致表達的酶失活，使其不能有效對群多普利進行催化水解。由此，我們可以看到人ces1基因的突變與藥物的代謝異常有密切的關聯。

奧司他韋(Oseltamivir)是一種強效的選擇性的流感病毒神經氨酸酶抑制劑，主要用于由甲型或乙型流感病毒引起的流行性感冒的治療和預防，是HCE1的特異選擇性底物[25]。HCE1可以將奧司他韋激活為活性代謝產物——奧司他韋羧化物(Oseltamivir carboxylate)，但若HCE1酶活性缺失，可能導致奧司他韋不能發揮很好的臨床療效。Zhu 等[26]報道，轉染野生型基因ces1的Flp-In-293細胞和人類肝組織的S9組分均能快速催化奧司他韋為活性代謝產物，攜帶有基因突變p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 的酶催化活性卻顯著下降，其中攜帶p.Gly143Glu 的酶最大水解速率僅有野生型酶的25%，而攜帶p.Asp260fs的酶不能檢測到藥物催化活性。Shi 等[27]也發現攜帶ces1基因Cys87Phe 和Arg199His 位點突變的個體其HCE1對于奧司他韋的酶水解速率顯著下降，而攜帶ces1基因Ser75Asn 位點突變的個體其HCE1對奧司他韋的水解活性則可提高約25%。這表明人ces1基因的突變可影響HCE1對奧司他韋的水解活性，這對于評價奧司他韋的臨床療效、耐受性及毒性等方面有著重要的指導意義[28-29]。隨著年齡的增長，HCE1的表達水平和酶活性也會隨之變化，Yang 等[30]報道，通過對104例人肝組織樣本中HCE1的表達水平及對奧司他韋酶活性檢測研究，發現隨著人年齡的增大其HCE1的表達水平不斷提高，成人肝微粒體HCE1對奧司他韋的水解活性分別是兒童及嬰兒組的4倍和10倍左右，表明HCE1的表達水平可以反映其酶活性，與Shi 等[25]的研究結論一致。

HCE1可以快速促進哌醋甲酯(Methylphenidate)在體內的代謝失活和清除過程，哌醋甲酯是治療注意缺陷多動障礙(Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)的一線藥物[31]。HCE1對于哌醋甲酯的2種同型異構體(d-哌醋甲酯和I-哌醋甲酯)的代謝作用有立體選擇性，它是哌醋甲酯在肝內發生首過立體選擇性清除的一種關鍵性羧酸酯酶，無藥理活性的I-哌醋甲酯的清除速度較有藥理活性的d-哌醋甲酯的快[32]。若血漿中的HCE1酶活性缺失，即HCE1不能有效將哌醋甲酯水解為萘基酯，將會導致血漿中的哌醋甲酯濃度顯著升高，則很容易誘發藥物毒性。Zhu 等[14]在哌醋甲酯代謝能力明顯缺陷人群的研究中識別了2個有功能的基因突變體——p.Gly143Glu 和p.Asp260fs。此后的許多研究均證實，攜帶 p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 其中的一種或兩種基因突變的個體其HCE1酶活性顯著降低，對哌醋甲酯的藥物代謝動力學有明顯的改變。Nemoda 等[31]通過對122例匈牙利注意缺陷多動障礙患者人群ces1基因Gly143Glu 多態性與哌醋甲酯代謝間的關系研究發現，Gly143Glu 遺傳多態性與哌醋甲酯的臨床療效沒有顯著的關聯，但有5例攜帶Glu 等位基因的患者僅以小劑量哌醋甲酯就能有效消除注意缺陷多動障礙癥狀。

奧昔布寧(Oxybutynin)是一種具有較強的平滑肌解痙作用和抗膽堿能作用的解痙藥物[33]，可有效降低膀胱內的壓力，主要用于無抑制性和返流性神經源性膀胱功能障礙患者與排尿有關的癥狀緩解，如尿急、尿頻、尿失禁、夜尿和遺尿等。奧昔布寧化學結構中含有酯鍵，因此HCE1也可以有效促進奧昔布寧的水解代謝。奧昔布寧在肝微粒體中的水解代謝活性主要取決于HCE1，且其藥物的水解速率與HCE1的含量呈正相關。Sato 等[33]關于人肝微粒體和肝細胞液的藥物動力學研究發現，真核重組表達的人肝微粒體羧酸酯酶中，HCE1對于奧昔布寧的藥物水解代謝速率明顯大于HCE2。Wong 等[34]報道，舒林酸(Sulindac)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、吲哚美辛(Indomethacin)等非甾體類抗炎藥物因含有較大的酰基基團，培養的人胚腎293細胞內的HCE1能介導此類藥物的水解代謝失活過程，且HCE1有很高的酶動力學活性，可導致此類藥物的腫瘤細胞殺傷活性消失。若將舒林酸等非甾體類抗炎藥物運用于腫瘤的臨床治療，應聯合使用HCE1的抑制藥物以達到抑制HCE1酶活性，從而達到充分發揮舒林酸等非甾體類抗炎藥物的治療效果。動物實驗[34]也表明，雙(對硝基苯基)磷酸酯(Bis-p-nitrophenyl phosphate,BNPP)與舒林酸的聯合使用比舒林酸的單獨使用，對裸鼠人胃腺癌移植瘤的腫瘤生長抑制效果更加明顯，這可將藥物的腫瘤抑制率從28%提高到57%(P=0.037)。

3 HCE1的毒物代謝功能

有機磷酸酯的急性中毒可以通過血清膽堿酯酶的含量進行檢測，而慢性中毒可以通過紅細胞乙酰膽堿酯酶的含量進行檢測。單核細胞HCE1的含量很容易受到有機磷酸酯暴露水平的影響，有機磷酸酯可以完全抑制HCE1的酶活性，因此HCE1可以作為一個有效衡量有機磷酸酯暴露水平的一個指標[19]。早前有研究發現，馬拉硫磷(Malathion,4049)中毒患者在其血清膽堿酯酶水平恢復正常及中毒癥狀緩解之前，其外周血單核細胞中 HCE1的染色可被完全抑制[19]。Hemmert 等[35]通過建立 HCE1與環沙林(Cyclosarin)相互作用的分子模擬結構發現，HCE1還可以立體選擇性結合到神經毒素環沙林，同時還能自發性地水解神經毒素沙林(Sarin)。目前HCE1被作為一種氣體神經毒素的藥物靶點進行研究，也許HCE1酶活化中心的某一氨基酸突變，可以使之成為有機磷酸酯的有效水解酶類。酶活化位點的單個氨基酸突變對于有機磷酸酯的解毒和代謝是一個很好的治療或預后的藥物作用靶點，外周血單核細胞的HCE1含量及酶活性對于其環境代謝底物的療效及毒性評價來說是一個良好的指標。

4 HCE1的脂質代謝功能

HCE1在肝臟及其他外周器官中膽固醇和脂肪酸的代謝和運輸的過程中發揮重要作用[8-9]。甘油三酯脂酶主要包括激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,LIPE)、脂肪甘油三酯脂酶(Adipose triglyceride lipase,PNPLA2)和HCE1，脂肪細胞的酯解作用主要是通過甘油三酯脂酶家族成員介導的，其中HCE1亦被稱為膽固醇脂水解酶(Cholesterol ester hydrolase,CEH)，其含有膽固醇脂水解酶活性，可以有效水解巨噬細胞中的膽固醇酯[36-37]。細胞質中脂質小滴膽固醇酯的水解代謝是巨噬細胞膽固醇逆向轉運(Macrophage reverse cholesterol transport,mRCT)過程的重要步驟。Zhao 等[38]以單核細胞/巨噬細胞系研究HCE1的過表達時發現，HCE1的高表達水平可以增強巨噬細胞內膽固醇逆向轉運過程，可增加細胞內膽固醇的流出量，同時也可減少細胞內膽固醇酯的積聚，因此該酶在泡沫細胞及動脈粥樣硬化形成過程中可能發揮著重要的作用[37,39]。此外，以二苯甲酰(Benzil，HCE1的特別抑制劑)處理負載有膽固醇的THP1巨噬細胞的研究也發現，在有利于膽固醇酯流出細胞的情況下，細胞內仍有大量膽固醇滯留[40]。另外，HCE1可識別甘油三酯、棕櫚酰CoA、長短鏈酰基甘油、中長鏈酰基肉毒堿、長鏈酰基CoA 酯等內源性底物[41-42]。HCE1含有脂肪酰基CoA 水解酶、酰基CoA：膽固醇酰基轉移酶活性[43]，可參與膽固醇的代謝過程，如膽固醇酯的水解、脂肪酰基CoA 的水解、酰基CoA：膽固醇酰基的轉移、酰基肉毒堿的水解，脂肪酰：乙酯的合成等反應[44]。

HCE1在體內脂肪酸的代謝過程中也發揮著不可忽略的作用。Steinberg 等[45]報道，肥胖個體的皮下脂肪組織和內臟脂肪組織中ces1基因的mRNA 表達水平顯著高于瘦弱個體。Jern?s 等[46]也發現，肥胖個體HCE1表達水平明顯高于瘦弱個體，皮下脂肪組織中HCE1含量顯著高于內臟脂肪組織，而隨著人體重的減輕，其HCE1表達水平逐漸降低。脂肪組織中HCE1表達水平可以反應體脂和脂肪的含量，并與總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等代謝指標有關，表明脂肪組織內HCE1表達水平的提高與肥胖及體內脂質代謝功能紊亂密切相關。Marrades 等[8]也證實，肥胖患者腹部皮下脂肪組織樣本中HCE1的表達水平上調，且與腰圍、腰圍/高度比、血漿葡萄糖水平、甘油三酯水平、心血管危險因素——總膽固醇/高密度脂蛋白膽固醇比值呈正相關。Nagashima 等[9]通過34例腹部外科手術患者的皮下、網膜、腸系膜脂肪組織樣本研究，發現皮下脂肪、腸系膜脂肪的ces1基因mRNA 表達水平與細胞溶質中的甘油三酯脂酶活性以及肥胖呈正相關。以上研究均表明，HCE1可能參與人體脂肪組織中的脂質代謝過程，其基因突變及表達失調可導致脂質代謝紊亂，與肥胖的胰島素抵抗和心血管疾病誘發因素存在密切的關聯，可誘發肥胖相關疾病(如高膽固醇血癥)的發生和發展。

5 HCE1早期診斷肝細胞肝癌

首次研究HCE1在正常肝臟組織和肝癌組織的表達差異是在2002年，Lim 等[47]通過雙向聚丙酰凝膠電泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)和基質輔助激光解吸/電離時間飛行質譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI–TOF MS)法分析6例肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者組織樣本中的蛋白表達差異水平發現，肝癌組織樣本中HCE1的表達水平顯著低于正常肝組織及肝硬化組織，因此Lim 等[47]大膽提出HCE1可作為肝細胞肝癌檢測的一個腫瘤標志物。接著，Liu等[48]利用抑制消減雜交法(Suppression subtractive hybridization,SSH)及cDNA 微陣列方法也證實肝細胞肝癌患者的肝癌組織中HCE1含量較低。Na 等[10]報道，通過對58例肝細胞肝癌患者的肝組織樣本研究也發現，與正常肝組織相比，肝癌組織中HCE1表達水平顯著下調，表明肝癌細胞的生長可能會抑制HCE1的表達水平，但具體機制仍不清楚。因此，Na 等[10]通過采用磁珠法免疫共沉淀(Magnetic bead-based immunoprecipitation)及納升級液相色譜串聯質譜(Nano-LC-MS/MS)方法分析了從肝細胞肝癌患者肝組織分泌到血漿的N-連接糖蛋白，首次發現HCE1在肝細胞肝癌患者血漿中的含量較高，并顯著高于健康志愿者、肝硬化、慢性肝炎、膽管上皮癌、胃癌及胰腺癌患者血漿中HCE1的含量，且該指標作為肝細胞肝癌標志物的靈敏度及特異度分別為70.0%及85.0%。Paik 等[11]在2012年申請的美國專利(Patent No:US 8198038)中也證實肝細胞肝癌患者血漿中HCE1的含量是健康志愿者的2～5倍，表明HCE1可作為早期診斷肝細胞肝癌的一個良好的血漿糖蛋白標志物。一般來說，N-連接糖蛋白可從內質網或高爾基體釋放到血漿中，因此可導致細胞內蛋白水平下降。在肝細胞肝癌發展的過程中，血漿中HCE1分泌增多可能是肝內HCE1蛋白的N-連接糖基化激活反應所引起的，可導致肝內組織及細胞內HCE1含量下降。

6 總結與展望

HCE1主要分布在肝臟組織，是一個很重要的肝臟藥物代謝水解酶，能有效催化羧酸酯類、氨甲酸酯類、酰胺類、硫酯類等藥物、前體藥物及環境毒物的水解和代謝，是評價代謝底物的臨床療效和藥物毒性的一個良好的血清指標，有望成為有機磷酸酯毒物治療或預后的藥物作用靶點。HCE1在人體內脂質代謝方面也發揮著重要作用，參與膽固醇酯的水解和逆向轉運過程，其基因突變及表達失調可導致脂質代謝紊亂，與肥胖、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化等心血管疾病誘發因素存在密切的關聯。由于肝細胞肝癌患者血漿中HCE1表達顯著升高，HCE1有望成為早期診斷肝細胞肝癌的一個良好的腫瘤標志物。

HCE1作為一種極具應用前景的羧酸酯酶，在藥物代謝、毒物代謝、脂質代謝、肝癌診斷等方面有著十分重要的意義，但目前仍存在許多亟待解決的問題，如人ces1基因突變與藥物臨床療效的關系，HCE1表達失調誘發脂質代謝紊亂的具體機制，HCE1與肝細胞肝癌的發生發展的關系等，需要在以后的研究中進一步闡明。鑒于早期診斷肝細胞肝癌的特殊功能，需要選用更靈敏和特異的檢測方法，來定量測定人體血漿中HCE1的含量，從而為肝細胞肝癌的臨床早期輔助診斷和治療預后提供指導依據。

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