不同種雛鴨建立鴨乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的實驗

郝友華，李安意，丁紅暉，朱 帆，趙西平，楊東亮

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院臨床免疫研究室，武漢 430030； 2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院動物實驗研究中心，武漢 430030）

鴨乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）屬嗜肝DNA病毒科，禽嗜肝DNA病毒屬，其病毒顆粒為球型，有囊膜，直徑40～50 nm。DHBV主要經卵垂直傳播，雛鴨自然感染率高，感染后無明顯臨床癥狀。DHBV與人乙型肝肝炎病毒很類似，因而鴨乙型肝炎病毒及及其感染模型是在當前研究嗜肝DNA病毒復制機制和篩選抗乙型肝炎病毒藥物中扮演重要作用［1-2］。建立雛鴨感染DHBV模型的影響因素較多，本研究主要比較了不同種雛鴨DHBV自然感染率和人工感染率，以及不同人工感染DHBV方法對病毒感染率的影響，觀察了DHBV感染后鴨體內病毒載量穩定性，并對不同DHBV感染模型應用抗病毒藥物抗病毒效果進行了比較分析，對進一步完善鴨乙肝病毒感染模型及其實際應用有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

2日齡櫻桃谷鴨雛鴨80只，購自武漢市春江禽業有限責任公司；2日齡湖北麻鴨雛鴨分兩批次：分別為146只，產地湖北天門；130只，產地湖北漢川。人工接種DHBV病毒株，拷貝數為2.0×107copies/mL，由本研究室制備保存。Real-time PCR試劑盒為SYBR? Premix Ex TaqTM（大連寶生物工程有限公司）。

1.2.1 鴨DHBV先天感染篩查

2日齡雛鴨下肢內側，消毒后用一次性針頭刺破表皮，取血50μL；置離心管中，37℃放置30 m in，12000 rpm×10 m in離心；分離血清，取血清煮沸10 m in，12000 rpm×10 min離心，取其上清做PCR模板，鑒定是否有DHBV自然感染。

1.2.2 鴨DHBV人工感染

未自然感染DHBV的雛鴨，分別經靜脈注射和腹腔注射人種接種DHBV病毒株，每只200μL，接種后第10天，采血，PCR方法鑒定DHBV感染。

1.2.3 DHBV-DNA的PCR定性檢測和定量PCR檢測

根據DHBV序列分別設計2對引物，定性PCR引物序列為：S1：5＇-TGG CCT AAT CGG ATT ACT GG-3＇，S2：5＇-CAG CGT GGC TAA TTG AGT TA-3；定量PCR引物序列為：P1：5＇-GATACTGGAGCC CAAACC-3＇，P2：5＇-GGCAGAGGAGGAAGTCAT-3＇，由上海invitrogen公司合成；由上海英駿公司合成。定性PCR擴增條件分別為：94℃50 s、61℃45 s、72℃50 s、30個循環；定量PCR擴增條件：94℃5 s、58℃5 s、72℃15 s、40個循環。

1.2.4 在DHBV感染的鴨模型中觀察拉米呋啶抗病毒實驗

實驗共分為4組，每組10只鴨，分別為（1）人工感染麻鴨組，此組給予安慰劑處理：三蒸超純水，每只1 m L/kg，一天一次；（2）DHBV自然感染麻鴨組，人工感染櫻桃谷鴨組、人工感染麻鴨組，此3組口服給拉米夫定：每只100 mg/kg，一天一次，給藥15 d。實驗各組在用藥前（D0），用藥第5天（D5），用藥第10天（D10），用藥第15天（D15）和停藥后第5天（D20），采血，定量PCR檢測DHBV-DNA載量變化。

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1.2.5 統計方法

數據采用SPSS軟件（13.0版本）進行統計分析，以P＜0.01為有顯著性差異。

2 結果

2.1 DHBV在不同鴨種中自然感染率比較

分別采集櫻桃谷鴨、湖北麻鴨的血清，以處理后的血清為模板，應用定性PCR方法擴增DHBV片段，PCR產物大小為422 bp即為陽性。經檢測在80只櫻桃谷鴨血清中，DHBV陽性有7只，陽性率為8.75％；146只湖北天門麻鴨（湖北麻鴨-1），DHBV陽性有26只，陽性率為17.80％，131只湖北漢川麻鴨（湖北麻鴨-2），DHBV陽性有14只，陽性率為10.68％（圖1）。統計分析顯示：湖北麻鴨-1的自然感染率明顯高于其它2組（P＜0.01）。

2.2 不同人工接種方法致雛鴨DHBV感染率比較

靜脈注射和腹腔注射是DHBV人工感染雛鴨的兩種常用方法。分別取20只未感染DHBV湖北麻鴨雛鴨，用同一DHBV陽性毒株，經鴨腿脛靜脈注射和腹腔注射病毒；并與10只未感染DHBV的湖北麻鴨雛鴨一起飼養，10 d后采集鴨血清，定性PCR方法檢測DHBV陽性率，結果顯示：20只雛鴨靜脈注射組，有16只出現陽性，陽性率為80％，20只雛鴨腹腔注射組13只陽性，陽性率為65％，未感染組沒有出現DHBV陽性個體鴨（圖2）。

圖1 鴨乙肝病毒在雛鴨中的自然感染率（＊＊有統計學差異）Fig.1 Natural infection rate of duck hepatitis B virus in ducklings（＊＊Statistical significance）

圖3 不同鴨種人工接種后DHBV感染率Fig.3 Infection rates in the different duckspecies by artificial inoculation

圖2 不同人工接種方法致雛鴨DHBV感染率Fig.2 Infection rates in ducklings caused bydifferent artificial inoculation methods

2.3 不同鴨種人工接種DHBV感染率比較

分別取未感染DHBV的櫻桃谷鴨和湖北麻鴨雛鴨各70只，用同一DHBV病毒株，經腹腔注射途徑人工感染兩種鴨雛鴨，10 d后采集鴨血清，PCR方法檢測DHBV感染狀況。結果顯示：有48只櫻桃谷鴨DHBV陽性，陽性率68.57％；有44只湖北麻鴨DHBV陽性，陽性率為62.85％。二者間無明顯差異（P＞0.05）（圖3）。

2.4 DHBV感染后鴨體內病毒血癥變化

為觀察DHBV感染后鴨體內病毒DNA載量的變化，分別對DHBV自然感染陽性湖北麻鴨、人工感染DHBV陽性的櫻桃谷鴨和湖北麻鴨3組，各10只，從13日鴨齡開始，每間隔7 d，采集鴨血清，定量PCR檢測病毒DNA的載量，連續觀察28 d。結果見圖4。3類DHBV感染鴨體內病毒載量維持在106～108copies/m L，3組間DNA載量變化無明顯差異（P＞0.05）。

2.5 在DHBV感染鴨模型中拉米呋啶抗病毒效果

根據實驗分組，分別給予安慰劑和拉米呋啶抗病毒藥物處理，每組使用的動物分別為：處理組-1為櫻桃谷鴨人工感染、處理組-2為湖北麻鴨人工感染、處理組-3為湖北麻鴨自然感染、安慰劑組為麻鴨人工感染。在用藥前（D0），用藥第5天（D5），用藥第10天（D10），用藥第15天（D15）和停藥后第5天（D20），采血，定量PCR檢測DHBV-DNA載量變化。結果見圖5：給藥后第10，15天后，除安慰劑組外，其余3組鴨血清DHBV-DNA顯著降低，經統計學分析，病毒下降有顯著的統計意義（P＜0.05）；停藥5 d后，鴨體內DHBV-DNA滴度都出現了明顯的反彈；3組間病毒變化趨勢一致；但給予安慰劑組，鴨體內DHBV病毒沒出現明顯下降和反彈。

圖4 DHBV感染后鴨體內病毒DNA載量的變化Fig.4 Changes of in vivo viral DNA load in DHBV-infected ducks

圖5 抗病毒藥物在不同鴨模型中抗病毒效果Fig.5 Antiviral effects of the drug in different duck models

3 討論

鴨乙肝病毒在不同種雛鴨中自然感染率存在明顯差異［3］。本研究應用PCR方法，比較了湖北麻鴨和櫻桃谷對DHBV感染率，結果顯示：湖北地區孵化的櫻桃谷鴨DHBV自然感染為8.75％，湖北麻鴨DHBV自然感染率約為10％～20％；湖北麻鴨自然感染DHBV的比率明顯高于櫻桃谷鴨，與瞿滌等前期研究結果類似［4］。但即使是同為湖北麻鴨種，因來源不同其自然感染率也不同，這提示除了鴨的種類差異影響DHBV的自然感染率外，人工孵育鴨的不同方式也可能是影響其自然感染率不容忽視的重要因素。

雛鴨人工感染DHBV是制備鴨乙肝病毒感染模型的重要措施，其主要受人工感染的途徑和雛鴨種類的影響［5］。人工感染的途徑比較多，但以鴨腿脛靜脈注射和腹腔注射途徑感染最為常用。本研究比較了這兩種途徑感染DHBV的感染率。結果顯示：這兩種途徑均能使雛鴨感染DHBV，但靜脈注射途徑感染率明顯高于腹腔注射。而鴨種對人工感染率的影響不明顯，本研究中不同種雛鴨人工感染DHBV后的感染率分別是：櫻桃谷鴨為68.57％，湖北麻鴨為62.85％，二者間無明顯差異。這提示鴨的種類不是影響DHBV實驗感染雛鴨是否易感的主要因素。此外，本實驗中將未自然感染DHBV的雛鴨與人工感染DHBV的雛鴨一起飼養，10 d后，這些鴨體內DHBV仍為陰性，提示DHBV傳播主要以垂直傳播途徑為主，水平傳播途徑對病毒的傳播影響較小。

DHBV感染鴨后，鴨體內病毒血癥的穩定性和持續時間是成功建立鴨人工感染DHBV實驗模型重要參數［6］。本研究比較了人工DHBV感染鴨和自然感染后，鴨體內的病毒血癥和持續時間，結果顯示：鴨體內病毒血癥在不同途徑感染中都能穩定持續存在；但自然感染的鴨中，不同個體病毒DNA載量波動較大；在病毒持續時間上無明顯差異。此外，本研究還比較了抗病毒藥物在不同DHBV感染模型中抗病毒效果，結果顯示：人工感染組和自然感染組抗病毒效果的變化趨勢具有較好的一致性，而且鴨種的差異對其也無明顯影響。但櫻桃谷鴨個體較大，實驗中用藥量等耗量也較大，這在該模型的實際應用中應考慮。

總之，鴨的種類，繁殖方式及人工感染途徑均影響著DHBV感染率，雖然DHBV感染雛鴨后，鴨體內均可有持續性的病毒血癥；但在建立鴨乙肝病毒感染模型中，為保證不同組別間病毒血的基線特征一致性、實驗結果的穩定性和可比較性，應盡量選擇未有DHBV感染的1～3日齡雛鴨進行人工感染建立模型，而且最好選用同一來源、同一批次的毒株作為感染源。

［1］Schultz U，Grgacic E，Nassal M.Duck hepatitis B virus：an invaluablemodel system for HBV infection［J］.Adv Virus Res.2004；63：1-70.

［2］胡靜，姚云清。鴨乙型肝炎病毒模型的研究意義［J］。檢驗醫學與臨床，2007；4（4）：284-285.

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［4］瞿滌，聞玉梅，林飛卿，等。七個鴨種攜帶鴨乙型肝炎病毒的研究［J］。中華傳染病雜志，1985；4（3）：133-135.

［5］胡權，楊東亮。鴨乙型肝炎病毒感染模型的研究進展［J］。實用肝臟病雜志，2007；10（3）：201-204.

［6］談博，張豐學，操紅纓，等。鴨乙型肝炎病毒感染模型及其方法學研究進展［J］。熱帶醫學雜志，2005；5（1）：111-113.