大型實驗動物屏障設施環境微生物和塵埃粒子的動態監控

王 晶，劉 偉，袁水娟，談小倩，謝 恩，徐 平，芮 榮

（1.南京農業大學動物醫學院，南京 210095；2.中國科學院上海實驗動物中心，3.上海斯萊克實驗動物有限責任公司，上海 201615）

大型實驗動物屏障系統環境的穩定是保障實驗動物規模化生產、供應和動物質量的基本條件。屏障系統內的環境微生物控制與其生產種群的來源、空氣潔凈度、物品的消毒或滅菌以及人員的進出和操作等有關。在現行的實驗動物設施與環境國家標準(GB14925—2001)中，只規定了靜態狀況下屏障系統應該達到的基本條件或標準［1］，而對動態運行中的屏障系統沒有作出明確的規定。在生產型屏障系統中，屏障內落下菌與塵埃粒子的變化會因動物飼養種類，密度，飼養工作的不同而呈現不同的變化規律。本實驗選擇兩個飼養不同品種動物的屏障系統，在不同時間段對屏障系統進行空氣落下菌與塵埃粒子的測定，研究生產型屏障系統動態環境下微生物和塵埃粒子的變化規律，并分析生產活動對環境指標的影響，為實驗動物屏障系統動態環境的質量標準制定提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器與試劑

直徑9 cm的塑料培養皿，超凈工作臺，顯微鏡，生化培養箱，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平，恒溫水浴鍋，FLUKE983激光粒子計數器，不銹鋼傳遞罐，冰箱，無菌工作衣及無菌手套等。營養肉湯培養基(上海康潤生物科技有限公司);瓊脂粉(上海盛思生化科技有限公司)。

1.2 試驗場所環境及飼育方式

1.2.1 屏障系統等級及環境：清潔級屏障系統［Ⅰ］：小鼠飼養屏障，全部飼養小鼠，測定地點選擇該屏障小鼠飼養室及潔凈走廊和污物走廊。清潔級屏障系統［Ⅱ］：大鼠和兔飼養屏障，其中有兔飼育室，和大鼠飼育室，分別測定兔飼育室和大鼠飼育室。

屏障系統［Ⅰ］和［Ⅱ］，單個飼育室容積172 m3，房間頂部進風口6個，四角回風口4個。屏障設施保持環境條件為：溫度(22±2)℃，濕度(50± 10)%，照明為晝夜交替各12 h。通風換氣次數為15次/h左右。

1.2.2 飼育方式：飼養生產工作時間為7∶00～15∶00，實驗期間噴霧消毒［2］時間為13∶00。大小鼠采用塑料籠具飼養，顆粒飼料飼喂，單獨水瓶飲水，每日更換部分籠具。添加飼料及更換水瓶。小鼠籠底板面積0.042 m2，籠內高度0.13 m，室內采用飼育架多層放置，小鼠房間放置小鼠籠1 728個，小鼠飼育密度10籠/m3，大鼠籠底板面積0.09 m2籠內高度0.18 m，大鼠房間放置大鼠籠600個，飼育密度約為3.5籠/m3，兔采用雙層鐵籠飼養，底板面積0.45 m2，籠內高度0.42 m，兔房放置兔籠288個，飼育密度約為1.67籠/m3。

1.3 落下菌與塵埃粒子的采集

普通瓊脂培養皿和激光粒子計數器于超凈臺紫外線照射20 min后，用無菌密封袋密封，用酒精噴霧消毒后從傳遞窗傳入。采樣人員經過沐浴后穿著無菌隔離衣，無菌隔離腳套，戴無菌口罩和無菌手套后進入。

培養皿放置位置：動物房一條對角線上取3點，正中一處，兩邊距墻1 m各放一個，清潔走廊，污染走廊等間距放置3個。放置方法：放置于地面，平板蓋打開，扣放于平板旁，計時30 min。塵埃粒子采樣方法：使用激光粒子計數器測定粒子濃度直徑≥0.3μm粒子濃度，采樣器放置高度1 m，采集空氣體積設定1 L。

放置時間：00∶00，06∶00，11∶00，16∶00，樣品重復采集3次。

1.4 樣品處理

1.4.1 動物房落下菌數量分析：采集好的培養皿放入37℃生化培養箱，培養24～48 h，取出于超凈臺中計錄菌落數，屬于相同房間的培養皿加權取平均值為平均菌落數。采用SPSS分析軟件［3］分析統計結果。

1.4.2 空氣塵埃粒子數統計：從激光粒子計數器讀取空氣中直徑≥0.3μm塵埃粒子數量，采用 S PSS分析軟件分析統計結果。

2 結果

2.1 落下菌落數量分析

屏障系統1內清潔走廊、污物走廊工作日落下菌數量在11∶00時均顯著高于其余時間(P＜0.05)，在其它三個時間差異不顯著(P＞0.05)。小鼠飼育室工作日落下菌數量在11∶00時顯著高于06∶00時和16∶00時(P＜0.05)，與00∶00時差異不顯著(P＞0.05)，小鼠飼育室工作日落下菌數量在00∶00時、06∶00時和16∶00時三個時間差異都不顯著（P＞0.05）。

屏障系統1內清潔走廊、污物走廊休息日落下菌數量在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室在休息日落下菌數量各時間點差異均不顯著（P＞0.05）。（表1）。

屏障系統2兔飼育室工作日落下菌數量在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在其它三個時間差異不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室工作日落下菌數量在11∶00時顯著高于06∶00時和16∶00時（P＜0.05），在16∶00時顯著低于00∶00時和06∶00時（P＜0.05），00∶00時與06∶00之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 直徑≥0.3μm塵埃粒子數量分析

屏障系統2兔飼育室休息日落下菌數量在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室休息日落下菌數量在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。（表2）。

屏障系統1內清潔走廊、污物走廊工作日塵埃粒子數在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在其它三個時間差異不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室工作日塵埃粒子數在11∶00時顯著高于其余時間（P＜0.05），在00∶00時顯著高于06∶00時和16∶00時（P＜0.05）。

屏障系統1內清潔走廊、污物走廊休息日塵埃粒子數在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室休息日塵埃粒子數在00∶00時顯著高于其余時間（P＜0.05），在06∶00時顯著高于11∶00時（P＜0.05），11∶00時和16∶00時差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

屏障系統2兔飼育室工作日塵埃粒子數在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在16∶00時顯著高于00∶00時（P＜0.05），00∶00時與06∶00時差異不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室工作日塵埃粒子數在16∶00時顯著低于其余時間（P＜0.05），在其它三個時間差異不顯著（P＞0.05）。

屏障系統2大鼠飼育室休息日塵埃粒子數在各時間段差異均不顯著（P＞0.05）兔飼育室休息日塵埃粒子數在11∶00時均顯著高于其余時間（P＜0.05），在16∶00時顯著高于00∶00和06∶00時（P＜0.05），00∶00時與06∶00時差異不顯著（P＞0.05）。（表4）。

表1 屏障系統1內小鼠飼育室和潔凈與污物走廊落下菌的檢測結果字典Tab.1 Detection of airfall bacteria in the mice room and corridor of barrier systemⅠ

表2 屏障系統2內大鼠飼育室與兔飼育室落下菌的檢測結果字典Tab.2 Detection of airfall bacteria in the rat room and rabbit room of barrier systemⅡ

表3 屏障系統1內小鼠飼育室和潔凈與污物走廊塵埃粒子的檢測結果Tab.3 Detection of dust in the m ice room and corridor of barrier systemⅠ

表4 屏障系統2內大鼠飼育室與兔飼育室字典塵埃粒子的檢測結果Tab.4 Detection of dust in the rat room and rabbitroom of barrier systemⅡ

3 討論

在符合國家標準的靜態實驗動物屏障系統引入實驗動物繁育群后，屏障系統內各項環境和空氣微生物指標均會發生明顯的變化。潔凈走廊，污物走廊和動物飼育室內落下菌和塵埃粒子數量均會升高，但由于動物生產的周期性和動物生活習性的相對固定，落下菌和塵埃粒子又隨著晝夜和不同生產時間產生規律性的變化。

屏障系統［Ⅰ］內潔凈走廊、污物走廊和小鼠飼育室和屏障系統［Ⅱ］內大鼠飼育室和兔飼育室內在工作日落下菌數量11∶00時均顯著高于06∶00時和16∶00時，表明飼養活動可使屏障內落下菌與塵埃粒子數明顯升高，人的飼養管理操作，如更換籠器具、配種、離乳、添加飼料等工作，可以增加落下菌與塵埃粒子的數量，這與實驗型屏障系統變化規律不同，實驗型屏障生產系統工作量較小，落下菌數量相對較低［4］。而潔凈走廊、污物走廊、小鼠飼育室、大鼠飼育室和兔飼育室內落下菌數量在16∶00時明顯降低，表明飼養結束后噴霧消毒可使屏障內落下菌與塵埃粒子數明顯下降，噴霧形成的大量液滴在空氣中會黏附大量塵埃粒子，由于重力作用很快降落到地面上，減少了空氣中落下菌與塵埃粒子的數量。大小鼠飼育室在00∶00時落下菌和塵埃粒子數量較高，表明屏障內大、小鼠夜間活動較多，這與大、小鼠屬于夜行性動物的行為特癥有關。屏障系統［Ⅰ］內污物走廊內落下菌與塵埃粒子數始終高于潔凈走廊，主要原因是潔凈走廊由于其空氣壓力梯度最高，排風能力強，細菌和塵埃含量始終保持在一個較低的水平。污物走廊在工作日則由于開門、門縫及壓差等緣故，使飼育室內的細菌與塵埃粒子進入，造成污物走廊細菌和塵埃粒子數量升高。

屏障系統［Ⅱ］中大鼠飼育室內的空氣落下菌和塵埃粒子數量都遠遠高于兔飼育室和屏障系統1中小鼠飼育室。其原因在于：大、小鼠均為塑料飼育籠內鋪設木屑墊料籠養，但大鼠的體型和活動量均大于小鼠，且飼料、飲水和排泄物都多于小鼠，大鼠的活動可以使時飼養籠中的細菌和塵埃更多的漂浮在空氣中。

在屏障系統［Ⅰ］和［Ⅱ］中，污物走廊、小鼠飼育室、兔和大鼠飼育室內落下菌和塵埃粒子數量均高于國家標準GB14925—2001對靜態實驗動物環境設施的要求，

其中大鼠飼育室都在100個/皿以上，而小鼠和兔飼育室在100個/皿以下，其中小鼠飼養室與張華瓊等報道的結果動物飼養間空氣落下菌數可控制在100個/皿以下一致［5］。而潔凈走廊除工作日11∶00外，落下菌數量均在3個/皿以下。可見，動態屏障系統內各功能區域落下菌與塵埃粒子數量與區域功能，工作狀態和動物品種有關。因此，在實際生產和環境監測中中，應根據飼養的動物種類、密度和飼養方式和不同功能區域來分別制定相應的落下菌和塵埃粒子監控指標。

空氣中的塵埃粒子的數量多少可以直接反映空氣的潔凈程度，在屏障系統中，空氣經過預初效，初效，中效，高效四級過濾后進入，對于直徑≥0.3 μm的塵埃，可達到99.97％的過濾效果［6，7］。屏障中塵埃粒子主要來源為動物和人的活動，通過對空氣中塵埃粒子的監測，可以間接反映動物與人的活動情況，而空氣中的微生物一般附著在塵埃粒子上，塵埃粒子濃度的變化可以間接反映飼育室內空氣細菌量的變化。塵埃粒子對動物和人的影響大部分是通過呼吸道引起的，少量是通過皮膚、眼及粘膜。直徑小于2.5μm的塵埃粒子可以直接進入肺部導致疾病發生。空氣中懸浮的塵埃粒子數量分布又呈現一定的規律，在動態屏障系統空氣中直徑≥0.3μmm的塵埃粒子數最多，且變化較明顯，故本研究選擇直接≥0.3μm塵埃粒子作為空氣潔凈度指標來評價屏障系統空氣潔凈變化程度。

屏障系統［Ⅰ］和［Ⅱ］中各功能區域直徑≤0.3 μm塵埃粒子數量都顯著高于靜態屏障，且不同功能區域與不同飼養室之間塵埃粒子濃度不同。

本實驗通過對生產型實驗動物屏障設施內的空氣落下菌與塵埃粒子進行實時監控，發現屏障系統各功能區域空氣落下菌與塵埃粒子變化有一定規律性，且變化在一定范圍內，在實際生產中，如果細菌數量或者塵埃粒子遠遠高于平均值，則有可能發生了管理上的問題、動物微生物控制質量下降或者設備運轉出現故障等，這對于評價實驗動物屏障設施的動態運行，制定屏障設施動態環境控制參數以及屏障設施的維護，實驗動物微生物質量的監控都有積極的參考意義。

［1］國家質量技術監督局.GB14925—2001，實驗動物環境及設施［S］.2001.26-28.

［2］宗阿南，董婉維，張艷華，等.動物實驗室房間消毒方法的研究［J］.中國比較醫學雜志，2003，13（6）：381-384.

［3］翟青新，沈黎，瞿葉清，等.實驗動物設施靜態與動態空氣落下菌數檢測結果分析［J］.實驗動物科學，2008，25（3）：39 -41.

［4］柯賢福，周莎桑，樓琦，等.實驗動物屏障系統微生物動態狀況［J］.中國比較醫學雜志，2010，20（3）：47-50.

［5］張華瓊，黃麟，夏爽，等.動物繁育設施空氣落下菌數觀察與分析［J］.實驗動物與比較醫學，2007，27（3）：195-197.

［6］徐平.實驗動物管理與使用操作技術手冊［M］.上海：上海科學技術出版社，2007：335-336.

［7］宗阿南，史曉萍，福山侑榮，等.屏障系統動物室單向流與亂流空氣凈化方式的細菌比較分析［J］.中國比較醫學雜志，2007，17（8）：476-477.