轉錄因子HAND2在中國散發先天性心臟病患者中的突變情況研究

沈 磊，李曉峰，申阿東，郭雅潔，李仲智

(首都醫科大學附屬北京兒童醫院，北京100045)

先天性心臟病(CHD)是最常見的人類出生缺陷和兒童非感染性疾病，發病率為新生嬰兒的0.8%～1%，占自然流產胎兒的10%，是導致一歲以下嬰兒死亡的主要原因［1］。CHD在出生缺陷中占首位，占所有人類先天性畸形的25%［2］。心臟在胚胎發育中從一個直管發育成四腔心是一個極其復雜的過程，需要許多轉錄因子、黏附分子、離子通道、信號分子和結構蛋白之間精確的相互調控。在這復雜過程中，任何一個環節中發生的任何錯誤都會導致CHD的發生。研究發現，轉錄因子HAND2在心臟發育過程中也發揮重要作用，主要相關部位為右心室、流出道及主動脈弓等，在右心室肥厚的患兒中可檢測到HAND2 mRNA的表達是升高的。Huang等［3］在對HAND2基因進行研究后認為，在右室流出道畸形的病例中進行HAND2基因突變的檢測更能提高直接有效的證據來證實HAND2基因是CHD的候選致病基因。我們對131例CHD患兒的HAND2基因突變情況進行報道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2004年9月～2007年12月在首都醫科大學附屬北京兒童醫院心臟中心就診的131例漢族CHD患兒作為研究對象，男72例、女59例。本組患者均無家族史，為散發患者。CHD畸形均經過體格檢查、彩色超聲心動圖以及心臟外科手術或介入治療確診，并排除心血管系統之外的其他畸形和遺傳代謝性疾病。因HAND2基因在心臟發育過程中存在明顯的節段特異性，根據其作用部位，CHD病例入選標準為畸形與右心室、流出道、主動脈、心內膜墊有關。具體病種包括法洛氏四聯征(TOF)74例、肺動脈狹窄(PS)21例、肺動脈閉鎖(PA)6例、右室雙出口(DORV)3例、右室流出道狹窄(RVOTS)4例、房室間隔缺損(AVSD)13例、主動脈縮窄(CoA)9例及主動脈離斷(IAA)1例。對照組為同期在首都醫科大學附屬北京兒童醫院體檢兒童，共計250例。按照年齡、性別、民族以及地區與病例組進行匹配，無遺傳和出生缺陷疾病，與患兒無血緣關系。本研究設計已由首都醫科大學附屬北京兒童醫院倫理委員會批準。所有入選者在知情同意后入選，在對患兒進行樣本采集之前，患者或其法律監護人需要認真閱讀并簽署知情同意書。

1.2 HAND2基因突變的檢測 采用標準鹽析法提取外周血白細胞基因組DNA。應用Primer Premier 5軟件，根據已知外顯子及側翼內含子序列，按引物設計原則設計擴增引物，片段1:F為5'-GCCTCGGGATTGGCGTGA-3'，R為5'-CCTACCAGACTCATTTCGCCCTC-3'，長度為1 015 bp;片段2:F為5'-CCCCCTCTGCGGATGCCG-3'，R為5'-CACGAGATGCCATTTCTCAGC-3'，長度為802 bp;片段3:F為5'-CTAACCTTGGTAGCTTCTCTGC-3'，R為5'-GACCCCAACGGAAATGTTAG-3'，長度為756 bp;片段4:F為5'-CCCGCCAACCTACTCAAC-3'，R為5'-GCAGGTCAGGGTGACTGGT-3'，長度為492 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司北京合成部合成。PCR擴增產物經切膠、純化后，送北京天一輝遠生物科技有限公司直接測序。利用DNASTAR和Chromas軟件分析測序結果，檢測HAND2基因突變情況。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.5統計分析軟件進行統計學分析，計數資料應用χ2檢驗，計量資料應用t檢驗。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 編碼區突變 我們在實驗組中發現4例3種錯義突變(P11R、S36N和V83L)，這3種錯義突變中的S36N在250例正常兒童對照組中也檢測到1例，但由于其突變率＜1%(0.76%)，我們將其視為突變，而非SNP，其他兩種突變在對照組中均未檢測到。應用Polyphen軟件及SIFT軟件對這些錯義突變進行功能預測結果一致。發現P11R可以影響蛋白質功能，為有害性突變或非耐受性的突變，而S36N和V83L則對蛋白質功能無明顯影響，為耐受性突變。本研究中還發現了1個編碼區的雜合序列變異c.42C＞T，為同義突變(H14H)。該同義突變僅在1例CHD患者中檢測到，而在250例正常對照組中無此發現。

2.2 非編碼區突變 在本實驗中檢測到的HAND2的突變主要位于3'或5'UTR區域。所有的UTR區的突變發生于CHD患者組，而在對照組中無此發現。5'UTR區域發現2種突變(241A＞G，604C＞T)，臨床表型分別為AVSD和TOF;3'UTR區域發現1種突變(3237T＞A)發生于5例CHD患者，臨床表型分別為TOF 2例，PS 2例及DORV 1例。而在對照組中無此發現(P=0.008)。

圖1 3'UTR中的突變

3 討論

HAND2基因在右心室、肌小梁及源于神經嵴的主動脈弓的形成過程中發揮重要作用。神經嵴中HAND2的缺失可以導致流出道及主動脈弓動脈的對位不良，導致的心臟畸形表現為PA、IAA及右鎖骨下動脈食管后位［4］。右心室、共干及主動脈弓的畸形在 CHD患者中較為常見，約占 CHD中17%［5］。在包含4q33片段的基因組復制或缺失的患者中，CHD的發病率高達60%［6］，而不包括4q33片段的4號染色體長臂的其他片段的缺失或復制則很少伴發CHD［7］。這就表明在該區域中包含某個或某些與心臟發育密切相關的基因，人類的HAND2基因恰恰位于該區域。HAND2基因的高度保守性及其在小鼠心臟發育中的重要性表明人類的HAND2基因在心臟發育過程中同樣發揮重要作用，并可能為CHD的候選致病基因。

目前沒有關于HAND2基因在先心病患者中突變情況的研究報告，本實驗中我們在中國漢族先心病患兒中檢測到了HAND2基因突變，臨床診斷包括TOF、PS等，這些臨床表型與HAND2基因在心臟中的表達位置及敲除HAND2基因的小鼠模型都是相吻合的［4］。HAND2蛋白含有217個氨基酸，N端為1～85位氨基酸，為轉錄活性區，其中41～85位氨基酸是HAND2轉錄激活作用的關鍵部位;bHLH結構域為86～165位氨基酸，其中99～111位氨基酸為堿性區域，起到與DNA結合的作用，112～155位氨基酸為HLH結構域，發揮與自身或其他轉錄因子結合形成同源或異源二聚體的作用;C端為166～217位氨基酸。本研究中發現的3種錯義突變均位于HAND2蛋白的N端，因此均有可能影響其轉錄活性。因為HAND2蛋白的N端包埋于整個蛋白內部，而蛋白質內部的突變較表面的突變具有較高的致病性，所以這3種錯義突變均具備改變HAND2蛋白轉錄活性的可能。其中 V83L突變位于HAND2蛋白的核心轉錄活性區域(41～85位氨基酸)，因此考慮該種突變較P11R和S36N兩種突變影響蛋白功能的可能性更大。

突變導致疾病的可能性還與其突變位點的保守性呈正比，HAND2蛋白在鼠和雞中的同源性高達95%［8］。而本研究中所檢測到的3種錯義突變位點，其中11位的脯氨酸(P)和83位的纈氨酸(V)在人類、鼠、雞、蛙和斑馬魚中是高度保守的，而36位的絲氨酸(S)并不具備保守性。通過氨基酸位點的保守性分析P11R和V83L更具備影響HAND2轉錄因子活性的可能。突變導致的氨基酸位點的置換可能導致其化學性質的改變，P11R使非極性、疏水性脯氨酸突變成堿性的賴氨酸，氨基酸性質發生變化。而S36N的改變前后的絲氨酸和天冬酰胺都是極性、中性氨基酸，V83L的改變前后的纈氨酸和亮氨酸均為非極性、疏水性氨基酸，其性質都未發生改變。通過氨基酸性質的改變的角度分析，P11R的錯義突變改變轉錄因子活性的可能性比較大。本研究的實驗結果通過SIFT和Polyphon功能軟件進行預測，發現P11R成為致病突變的可能性最大，綜合分析以上影響蛋白功能的因素，考慮氨基酸性質的變化可能在改變蛋白功能方面發揮更大的作用。

基因表達的調控表現于多個水平，例如轉錄、轉錄后加工、mRNA的穩定性、翻譯、翻譯后修飾及蛋白降解，UTRs在其中發揮重要的調控作用。mRNA的3'或5'UTR包含可以調控mRNA多方面功能的序列，并因此影響基因功能［9］，如3'UTR含有許多調控因子的結合位點［9］。miR-1可特異表達于心臟和骨骼肌的前體細胞，過量的miR-1在心臟發育過程中導致增殖心室心肌細胞池的縮小。HAND2則是miR-1的結合靶點，確切的結合位點就位于3' UTR［10］。我們在病例組5'UTR中發現了2種不同的突變(241A＞G和604C＞T)，而對照組中則沒有。值得注意的是，我們在病例組中發現了5例相同的突變(3237T＞A)發生于3'UTR，而在對照組中無此發現，這5例患者共同的畸形特征為包含右室流出道或肺動脈的狹窄，經統計學分析，這種突變在兩組間存在顯著性差異。因為3'及5'UTR具備重要的調控功能，這些突變理論上可以影響HAND2蛋白的結構或功能。但是3'UTR的突變并非位于已知的miR-1的結合位點，進一步應用microRNA數據庫(miRBase)進行檢測，預測結果為該突變不位于任何一個已知的microRNA的結合位點上。雖然該突變未影響microRNA與HAND2的結合，但并不表明其對3'UTR的其他功能沒有影響，因此要確定該突變的確切意義仍需要進一步的功能實驗研究。

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