舒芬太尼預先給藥對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬CA1區(qū)形態(tài)學和腦組織總鈣的影響

王美芳，魏 華，孟盡海，王淑靜

(1寧夏醫(yī)科大學，銀川750004;2唐山市人民醫(yī)院;3寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院)

舒芬太尼是芬太尼N-4位取代的衍生物，是一種新型特異性μ阿片受體激動劑［1］，本實驗通過觀察舒芬太尼預先給藥后光鏡和電鏡下海馬CA1區(qū)形態(tài)學以及腦組織總鈣含量的變化，觀察舒芬太尼預先給藥對腦的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠70只，體質量280～320 g(寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，隨機分為5組，每組14只:假手術組(S組)既不燒灼雙側椎動脈，也不夾閉雙側頸總動脈;缺血再灌注組(I/ R組):燒灼雙側椎動脈，缺血前模擬Schultz等［2］預處理的方式泵入生理鹽水，即持續(xù)輸注5 min，暫停5 min，重復3次(容積1 mL/5 min，預先給藥過程30 min)，然后夾閉雙側頸總動脈15 min，再灌注24 h;舒芬太尼不同劑量預先給藥組(L組、M組、H組):燒灼雙側椎動脈，缺血前以I/R組同樣的方式分別泵入舒芬太尼0.5、1.5和4.5 μg/kg，然后夾閉雙側頸總動脈15 min，再灌注24 h。所有大鼠術前均禁食12 h，自由飲水。

1.2 全腦缺血再灌注損傷模型

1.2.1 模型的制備 采用大鼠四動脈阻斷法(pulsinelli-4vo法)［3］:SD大鼠3%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術臺上，于頸后正中1、2頸椎處切一長約1.5 cm切口，分離頸部肌肉暴露第1頸椎雙側翼小孔，用灼熱的大頭針燒灼閉塞雙側椎動脈，縫合傷口。改為仰臥位，備皮，消毒表面皮膚，頸前正中切口，分離雙側頸總動脈并掛線，縫合傷口，正常喂養(yǎng)。24 h后清醒狀態(tài)下將大鼠裝入鼠盒，行尾靜脈穿刺并留置靜脈套管針。給予肝素(50 IU/kg)抗凝，并接微量泵以備輸入生理鹽水和舒芬太尼。30 min預先給藥后將大鼠仰臥位固定，頸前正中行0.25%的布比卡因局部浸潤麻醉，剪開縫線，提出掛線，暴露雙側頸總動脈，用微型動脈夾同時夾閉雙側頸總動脈，造成全腦缺血，15 min后松開動脈夾，恢復腦血流灌注，縫合傷口。歸籠正常喂養(yǎng)。

1.2.2 造模成功的標準 造模鼠于缺血開始后30～60 s內意識喪失，翻正反射消失，嚼金屬反射消失，自主呼吸存在，眼球變白，松開動脈夾后1～2 min以上癥狀消失，造模成功。

1.3 觀察指標 再灌注24 h后。每組隨機取6只大鼠3%水合氯醛(450 mg/kg)腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛行心內前灌注，斷頭取腦，將左側大腦放入中性4%多聚甲醛行后固定。每組隨機選取2只右側海馬經固定、漂洗等步驟醋酸鈾染色—檸檬酸鉛染色電鏡下觀察海馬CA1區(qū)變化，其余8只同樣麻醉下斷頭處死，取左側大腦，吸水紙吸干表面水分和血液，放入冷凍管，－80℃冷凍保存，樣本收齊后一并測腦組織總鈣含量。①中性4%多聚甲醛后固定24 h的標本，依次經過脫水、透明、浸蠟、包埋等包成蠟塊。再經組織切片、撈片、HE染色后光鏡下觀察海馬CA1區(qū)形態(tài)學變化，參照Kitagawa等［4］提供的方法確定海馬CA1區(qū)的組織學分級(HG)。按以下標準分為4級:0級:無神經元死亡;Ⅰ級:散在的神經元死亡;Ⅱ級:大量的神經元死亡;Ⅲ級:幾乎全部的神經元死亡。②2只右側的海馬組織經過固定、漂洗、四氧化鋨后固定、脫水、浸透等步驟后，再經醋酸鈾—檸檬酸鉛染色，電鏡下觀察。③取左側腦組織，電子天平稱重后，加入硝酸與高氯酸(容積比4∶1)的混合酸4 mL將組織消解過夜，60～120℃梯度溫度排酸，去離子水定容至7 mL。采用濕法消解法用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測腦組織總鈣含量［5］。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件，計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。病理學分級(HG)采用Kruskal-Wallis秩檢驗分析，Mann-Whitney U檢驗作兩兩比較。以 P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 海馬CA1區(qū)形態(tài)學變化 S組:細胞形態(tài)結構完整，胞核無固縮，無淋巴細胞浸潤;I/R組:核固縮嚴重，神經細胞變性壞死多見，有少量淋巴細胞浸潤;L組:核固縮和神經細胞變性壞死較I/R組少見，有少量淋巴細胞浸潤;M組:無明顯的核固縮，神經細胞變性壞死較I/R組少見，可見淋巴細胞浸潤;H組:核固縮較I/R組少見，可見淋巴細胞浸潤，神經細胞有水腫。舒芬太尼預先給藥各組核固縮和神經細胞變性壞死M組最少見。見插頁Ⅰ圖5。

2.2 海馬CA1區(qū)病理學分級 見表1。

表1 5組大鼠再灌注24 h后海馬CA1區(qū)病理學分級比較(n=6)

2.3 海馬CA1區(qū)電鏡結果 S組:核膜規(guī)整，核仁均勻;粗面內質網無腫脹，無脫顆粒;突觸前、后膜，突觸間隙清晰;I/R組:核膜不規(guī)整，嚴重內陷，核固縮，核仁不均勻;粗面內質網擴張，數目減少，脫顆粒嚴重，出現大量溶酶體;突觸前、后膜不清晰，多數有融合，突觸間隙模糊不清;L組:核膜欠規(guī)整，內陷不嚴重，輕度核固縮;粗面內質網輕度擴張，個別正常，輕度脫顆粒，未見溶酶體;突觸前、后膜尚清晰，突觸間隙大致正常，少數有融合，突觸小泡增多;M組:核膜較規(guī)整，無明顯的內陷，偶見核固縮;粗面內質網輕度擴張，數目增多，大多正常;偶見溶酶體;突觸前、后膜清晰，突觸間隙大致正常，未見有融合，突觸小泡增多不明顯;H組:核膜較完整，內陷不明顯，輕度核固縮;粗面內質網輕度擴張，輕度脫顆粒;偶見溶酶體;突觸前、后膜尚清晰，突觸間隙大致正常，少數有融合，突觸小泡增多不明顯。見插頁Ⅰ圖6。2.4 腦組織總鈣含量 S、I/R、L、M及H組總鈣含量(μg/g濕重)分別為63.00±13.25、111.83± 10.81、96.79±15.40、76.00±13.31、82.89± 10.39。與S組比較，I/R組和舒芬太尼不同劑量預先給藥組總鈣含量均明顯升高(P＜0.05);與I/R組比較，舒芬太尼預先給藥組鈣總量均明顯降低(P＜0.05);不同劑量預先給藥組之間比較，M組和H組明顯低于L組(P＜0.05);M組和H組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。舒芬太尼預先給藥可以減少腦組織總鈣含量，以1.5和4.5 μg/kg顯著。

3 討論

舒芬太尼是一種強效鎮(zhèn)痛藥，藥理研究認為［6］其ED50是0.2 μg/鼠，大鼠甩尾法測得靜注舒芬太尼的鎮(zhèn)痛ED50為0.71 μg/kg，當給予10 mg/kg后產生緊張癥、翻正反射消失、耳廓反射和角膜反射阻滯，并呈劑量依賴性(1.25～5.00 mg/kg)出現震顫、陣攣性發(fā)作、呼吸困難等。本實驗在預先給予舒芬太尼的過程中所有實驗鼠均未出現呼吸困難等缺氧表現。

pulsinelli-4vo法所致的全腦缺血主要發(fā)生在海馬、紋狀體和大腦皮層等［3］，因此本實驗選取海馬CA1區(qū)進行形態(tài)學觀察及病理組織學分級(HG)。變性壞死、核固縮是細胞損傷的標志，淋巴細胞浸潤是抗損傷的表現。本實驗缺血再灌注組海馬CA1區(qū)核固縮嚴重，神經細胞變性壞死多見，病理學分級以Ⅱ級為主(66.7%)，電鏡下細胞核膜內陷、粗面內質網脫顆粒嚴重，突觸間隙模糊甚至融合，說明缺血再灌注可以導致海馬CA1區(qū)的損傷。有研究［7］認為pulsinelli-4vo法所致的全腦缺血再灌注損傷從再灌注的24 h開始，呈時間依賴性，72 h達高峰，與本實驗中觀察再灌注24 h的病理學分級以Ⅱ級為主一致。舒芬太尼預先給藥各組光鏡下核固縮嚴重程度和神經細胞變性壞死均較缺血再灌注組減輕，電鏡下核膜較完整，粗面內質網脫顆?，F象較輕，突觸間隙大致正常。尤其M組CA1區(qū)的病理學以Ⅰ級為主，損傷的程度最輕。表明1.5 μg/kg舒芬太尼預先給藥能夠有效減輕缺血再灌注所致的組織形態(tài)學變化。

腦缺血再灌注損傷的機制目前尚不清楚，但鈣超載是近幾年研究的熱點［8～11］，其發(fā)生機制主要表現在:腦缺血再灌注后能量缺乏，導致Na+-Ca2+-ATP酶失活，細胞膜去極化，導致大量的Glu釋放，NMDA受體激活，Ca2+大量內流。細胞內Ca2+大量蓄積可以通過以下途徑損傷細胞:① Ca2+激活Ca2+依賴性蛋白，使細胞內無害的黃嘌呤脫氫酶轉變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，誘導細胞死亡;②Ca2+通過激活蛋白酶NOS產生自由基，損傷線粒體，激活鈣激活的中性蛋白酶破壞細胞骨架;③Ca2+活化磷脂酶C和磷脂酶A2等Ca2+依賴性磷脂酶促進膜磷脂分解，并且在膜磷脂分解過程中產生大量的細胞毒性物質。

本實驗通過測定腦組織總鈣來間接反映細胞內鈣。缺血再灌注組的腦組織總鈣含量明顯高于假手術組，結合兩組海馬CA1區(qū)形態(tài)學的變化，表明腦組織總鈣含量與腦損傷的程度有關。不同劑量舒芬太尼預先給藥組腦組織總鈣含量明顯低于缺血再灌注組，說明舒芬太尼預先給藥能夠有效地減輕腦組織總鈣含量，從而減輕腦損傷，本實驗結果表明1.5 μg/kg較為顯著。馬銳等［7］的研究認為，舒芬太尼3 μg/kg腹腔預適應可以使局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經功能障礙癥狀得到明顯改善，腦梗死面積減小，具有腦保護作用，與本試驗結果相似。關于舒芬太尼的腦保護作用機制尚不清楚，有研究認為阿片類藥物通過抑制FADD蛋白，促進抗凋亡?？沟蛲隹赡苁鞘娣姨犷A先給藥腦保護機制之一［12，13］。

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