馬先蒿無性系建立的研究

李冬雪，高 珂，宋詩迎，徐 娜，姜長陽

（遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081）

1 引言

馬先蒿（Pedicularis resupinata）屬于玄參科，多年生草本植物，生長于草地、林緣、濕草甸子、針葉林下、山坡灌叢中和雜木林等環境中［1，2］，在我國的遼寧等地區有分布［3］，近年來也有栽培［4］。馬先蒿是一種藥用植物，具有多種藥用價值［5］。近年來，有關園藝工作者在對遼寧地區的野生植物進行調查研究時發現，分布于遼寧南部的馬先蒿，具有株型美觀、花色美麗、花期較長、抗逆性較強等特點，適于進行觀賞栽培。但是，由于多年來人們大量的采集藥用，野生馬先蒿的數量已很稀少，難以通過直接挖取野生的植株進行觀賞栽培。同時，由于馬先蒿在野生條件下結種數很少，也使其無法通過采集的種子進行繁殖。為此，研究者采用組織培養的方法建立馬先蒿的無性系，以期滿足人們栽培的需要。雖然已有馬先蒿研究的報道［6，7］，但迄今未見馬先蒿組織培養及無性系建立研究的報道。

2 材料與方法

2.1 材料

將大連甘井子區岔鞍山林下生長旺盛的馬先蒿植物采回實驗室，作為研究材料。

2.2 材料滅菌

參見王艷等［8］艾蒿研究的滅菌方法進行滅菌，即可獲得無菌嫩莖。

2.3 培養條件

參見張卓等［9］山苦菜研究的培養條件進行培養研究。

2.4 方法

2.4.1 愈傷組織的誘導及分化

將無菌嫩莖切成長0.2～0.3cm的莖段（下稱嫩莖），將葉柄基部的生長點切成長0.1cm具有生長點的莖段（下稱生長點），將葉片切成邊長0.3cm的塊狀（下稱葉片）后，接種于 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D2.0mg·L－1和 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1兩種培養基上，進行不同材料愈傷組織的誘導培養試驗。將獲得的愈傷組織在培養瓶內繼續培養50d，觀察愈傷組織的分化情況。愈傷組織誘導培養試驗重復2次，每種處理接種100個材料。

2.4.2 生根培養

將以上由生長點誘導的愈傷組織分化培養的不定芽從基部切下，接種到以1／3MS為基本培養基，附加不同濃度的NAA、IAA、IBA和ABT2號（下稱ABT）生長調節劑，進行不定芽的生根培養。不定芽生根培養試驗重復4次，每種處理接種100個不定芽。

2.4.3 試管苗移栽與定植

將進行著生根繼代增殖培養的試管苗從培養瓶中取出，置于底部有一層厚約0.2～0.4cm水層的搪瓷盤中，在光照下煉苗2d后，移栽到上層為6～7cm干凈河沙、下層為肥沃園土的溫室苗床中，進行試管苗的移栽試驗。移栽試驗重復3次，移栽株數分別為200株、400株和600株。

把移栽成活的試管苗于6月20日和30日，分2次定植到大連市區的花壇上，2次共定植1 100株。

3 結果及分析

3.1 不同材料、不同培養基對愈傷組織誘導和分化的影響

培養45d統計，結果見表1。由表說明，以葉片為材料，在兩種培養基上均不能誘導培養出愈傷組織；以生長點和嫩莖為材料，在兩種培養基上都能誘導形成愈傷組織，其中生長點的培養效果好于嫩莖。以生長點為材料，不僅誘導率最高，而且培養的愈傷組織長勢旺盛。由對培養過程的觀察可知，以生長點為材料，培養8～10d，有的材料開始生長愈傷組織，之后，隨著生長愈傷組織數量的不斷增加，愈傷組織也在不斷地生長。初期生長的愈傷組織為黃綠色，后來為由許多大小不等綠色顆粒組成的半球狀。把在兩種培養基上由生長點和嫩莖培養的愈傷組織繼續培養40d，并對培養過程進行觀察統計。觀察證明：由嫩莖培養的愈傷組織不分化；以生長點為材料在 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D2.0mg·L－1培養基上誘導培養的愈傷組織不分化，而在 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1培養基上培養的愈傷組織能分化出不定芽。繼續培養10d左右可見愈傷組織的上部分化出綠色的芽點，隨后，芽點逐漸生長為不定芽。繼續培養到40d時，平均每塊愈傷組織上能分化出2.8個高0.8cm左右的不定芽。不定芽具有4～6個葉片，呈綠色，生長較旺盛。2次重復試驗的結果基本一致。以上結果說明，MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1培養基是馬先蒿生長點愈傷組織誘導和分化培養的理想培養基。

表1 不同材料對愈傷組織誘導的影響

3.2 不同濃度調節劑對不定芽生根培養的影響

接種培養到30d時觀察統計，結果見表2。在不加生長調節劑的培養基上，不定芽不能生根；在附加4種生長調節劑的培養基上，不定芽均能生根并生長為試管苗；其中加ABT10mg·L－1的培養基上生根率最高，達到了96%，并且試管苗長勢旺盛。觀察表明，將不定芽接種到附加ABT 10mg·L－1的培養基上培養到4d時可見生長出白色的根原基，隨后，生根數不斷增加，根原基很快生長為白色的根，培養到30d時生根率為96%、生根數為7.6條／株、株高4.1～5.3cm，并且試管苗長勢旺盛。把在1／3MS＋ABT 10mg·L－1這種培養基上生根培養的試管苗剪成長1.5cm左右、具有2個生長點的不定芽，接種到相同的培養基上進行試管苗的生根繼代增殖培養，28d為一個生根繼代培養周期，可培養出一代與以不定芽為材料經過30d生根培養長勢一致的試管苗，生根率為98.5%，每一代的增殖系數為2.9。生根繼代增殖培養連續培養了6代，其結果基本一致，4次重復試驗的結果也基本一致。以上結果說明：1／3MS＋ABT 10mg·L－1這種培養基是馬先蒿不定芽生根培養和試管苗生根繼代增殖培養的理想培養基。

表2 不同濃度生長調節劑對不定芽生根培養的影響

3.3 試管苗移栽與定植

移栽8d左右可見試管苗開始生長，30d時統計，分別成活182株、373株和566株。共成活1 121株，平均成活率為93.4%，成活率較高。

定植后30d統計證明：共成活1 082株，定植成活率為98.5%。這說明，在溫室中移栽成活的試管苗，容易定植成活。

對定值成活的試管苗的觀察表明：定植成活的試管苗不僅保持了野生馬先蒿葉色濃綠，生長旺盛，根系約為野生同齡植株的1.5倍，當年不開花、翌年7月中旬開花、8月結果等植物學性狀，還保持了株型美觀、花色美麗、花期較長、抗逆性較強等有利于觀賞的特點。

4 結語

本研究定植的馬先蒿試管苗不僅保持了野生馬先蒿的植物學性狀，而且還保持了株型美觀、花色美麗、花期較長、抗逆性較強等有利于觀賞的特點。這一結果說明：本研究所獲得的試管苗可作為觀賞栽培的種苗使用，所建立的培養技術也為該物種種質保存奠定了技術基礎。

在本研究的試管苗生根繼代增殖培養中，28d為一個培養周期，每個培養周期的增殖系數為2.9。按照這種繁殖速度，一株試管苗每年可以繁殖出2.913（約為99萬）株試管苗。除掉各種不利因素影響，每年完全能保證繁殖出50萬株試管苗，這種繁殖速度完全能滿足栽培對種苗的大量需求。

［1］韓全忠，王振興.大連地區植物志（中冊）［M］.大連：大連理工大學出版社，1993：673.

［2］中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒（第四冊）［M］.北京：科學出版社，1975：71.

［3］李書心.遼寧植物志（下冊）［M］.沈陽：遼寧科學技術出版社，1991：336.

［4］包滿珠.花卉學［M］.北京：中國農業出版社，2004：431～414.

［5］南京中醫藥大學.中藥大辭典（上冊）［M］.上海：上海科學技術出版社，2008：394.

［6］王 靜，唐 王.馬先蒿屬野生花卉引種的可行性研究［J］.中國林副特產，2005（1）：5～7.

［7］王 薇，鄒艷敏，張 莉.馬先蒿屬植物的現代研究進展［J］.西北藥學雜志，2006，21（3）：142～144.

［8］王 艷，張 卓，王曉旭，等.艾蒿生長點及試管苗培養的研究［J］.遼寧大學學報，2011，36（4）：353～357.

［9］張 卓，王 艷，李 慧，等.山苦菜無性系建立的研究［J］.河南大學學報，2012，42（2）：187～191.