重組大腸桿菌產番茄紅素的研究進展

李燕飛，黃 磊，王 普，徐志南

(1.浙江工業大學藥學院，浙江杭州310032;2.浙江大學化學工程與生物工程學系生物工程研究所，浙江杭州310027)

番茄紅素是一種重要的天然植物色素，分子式為C40H56，是由11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵組成的多不飽和脂溶性烴類化合物，在自然界中主要存在于西瓜、番茄等蔬菜水果中［1］。番茄紅素具有很強的抗氧化能力，能夠通過接受電子激發態的能量，使單線態氧的能量轉移到番茄紅素中，從而淬滅單線態氧和清除自由基，防止DNA受到氧化破壞，減輕細胞損傷和預防癌癥的發生。此外，通過降低血清脂質過氧化和低密度脂蛋白的氧化，番茄紅素還能減輕脂肪肝病變程度，防止或延緩動脈粥樣硬化的形成［2，3］，近年來其相關產品的研發已成為國際上新藥研究的熱點。到目前為止，番茄紅素生產方法主要有天然提取法、化學合成法和發酵法三種。天然提取法主要是以西紅柿為原料通過萃取的方法獲得番茄紅素，但由于原料含量太低導致生產成本居高不下，且生產受季節影響明顯，無法滿足市場需求。化學合成法雖然成本較低，但由于雙鍵立體選擇性難以控制致使產物不可控，且使用的化學試劑在產品中會有不同程度的殘留。相比之下，微生物發酵法具有工藝簡單、生產周期短、不受季節氣候影響、成本低等優點，成為番茄紅素最為理想的生產方法。迄今為止，能夠用于生產番茄紅素的微生物主要有紅色細菌、三孢布拉氏霉菌、小球藻以及基因工程菌，特別是隨著轉基因技術的迅速發展，利用重組大腸桿菌生產番茄紅素已成為研究的熱點。

1 番茄紅素的生物合成途徑

1.1 番茄紅素在植物、真菌和細菌中的生物合成途徑 番茄紅素是類胡蘿卜素生物合成途徑中的一個重要的中間產物，研究表明所有的類胡蘿卜素都是由類異戊二烯化合物或萜類化合物合成的。在植物細胞液和真菌中，番茄紅素通過甲羥戊酸途徑(MVA途徑)合成:最初3個乙酰輔酶A分子通過失去1個分子的羧基縮合成3－甲基－3，5－二甲基戊酸(MVA)，MVA通過兩步激酶反應生成甲羥戊酸－5－磷酸(MVAP)和甲羥戊酸－5－焦磷酸(MVAPP)，MVAPP最后通過脫羧反應生成異戊烯焦磷酸(IPP)，IPP在IPP異構酶作用下異構化形成3，3－二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)，DMAPP再與3個分子的 IPP作用縮合依次生成牻牛兒焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛兒基牻牛兒焦磷酸(GGPP)，兩個分子GGPP在八氫番茄紅素合成酶(PSY)作用下聚合產生第一個無色類胡蘿卜素—八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經過連續的脫氫去飽和生成第一個有色類胡蘿卜素—番茄紅素。在細菌和植物質體中番茄紅素是通過MEP途徑合成的:由糖酵解途徑合成的甘油醛－3－磷酸(G3P)和丙酮酸(Pyr)通過1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸合酶(DXS)催化縮合生成1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸(DXP)，DXP由1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸還原異構酶(DXR)催化生成2－C－甲基－D－赤蘚糖－4－磷酸(MEP)，MEP再經過多步反應最后生成異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲酰基焦磷酸(DMAPP)［4－6］。具體代謝途徑如圖1所示:

1.2 番茄紅素在重組大腸桿菌中的生物合成途徑 和其他微生物相比，大腸桿菌具有生長快、遺傳背景清楚、基因操作方便等優點，已成為番茄紅素生產的首選菌株。大腸桿菌本身不能合成番茄紅素，但TCA循環的中間體如蘋果酸、草酰乙酸等可以形成類胡蘿卜素和脂類物質的骨架結構。大腸桿菌細胞內含有的成分如多萜醇、苯醌等化合物和番茄紅素一樣也都是由共同的前體IPP轉化而來。野生型大腸桿菌只能將IPP轉化成GGPP，而缺乏必要的酶將GGPP轉化成番茄紅素。研究表明只要將三個番茄紅素合成酶的基因(crtE、crtB和crtI)導入大腸桿菌就可以最終建立番茄紅素的生物合成途徑(圖2)［7～9］。其中crtE編碼GGPP合酶，引入crtE可以增加FPP向GGPP的轉化;crtB編碼八氫番茄紅素合成酶，可將GGPP轉化成八氫番茄紅素;而crtI編碼八氫番茄紅素脫氫酶，能促使八氫番茄紅素向番茄紅素轉化。

圖2 番茄紅素在大腸桿菌中的生物合成途徑

CDP－ME:4－二磷酸－2C－甲基－D－赤蘚糖;CDPMEP:4－二磷酸－2C－甲基－D－赤蘚糖－2－磷酸;ME－cPP:2C－甲基－D－赤蘚糖－2，4－環二磷酸;HMBPP:4－羥基－3－甲基－2－丁烯基－4－二磷酸;IspC－IspH:異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲酰基焦磷酸(DMAPP)的合成酶;plasmid(pAC－LYC):含有crtE、crtB和crtI基因的質粒;other isoprenoids:其他類異戊二烯。

2 利用代謝工程構建重組大腸桿菌生產番茄紅素

為達到利用大腸桿菌高效生產番茄紅素的目的，需要對番茄紅素的代謝途徑進行改造和優化。一般先要找到影響目標代謝流的關鍵基因，利用基因工程的方法使其過量表達，對其進行抑制或敲除等，但由于番茄紅素的合成涉及菌體內的多步酶催化反應，所以往往需要對多個基因同時進行操作。重組工程菌構建完成后，還可通過微生物培養工程的系統優化進一步提高番茄紅素的生產能力。利用代謝工程和發酵工程的方法提高番茄紅素產量一般有以下幾種方法:①同源基因的原位取代;②代謝旁路基因的敲除;③代謝途徑關鍵基因的過量表達;④多基因的協同調控;⑤工程菌培養條件的優化。

2.1 同源基因的原位取代 同源基因是來自同一物種或不同但相關物種的、在進化過程中源于共同祖先的基因，是在進化過程中特定基因在不同物種間的轉移和重排所產生的結果，這種基因演化是微生物進化的強大推動力。選取高酶活同源基因對代謝途徑中的關鍵基因進行原位取代是代謝工程研究中的常用手段。

大腸桿菌引入crtE、crtB和crtI三個關鍵基因后使得代謝流導向番茄紅素的合成，而這三個基因來源的不同會對番茄紅素的產量產生明顯影響。Ju－Eun Kim等［10］發現當crt基因來源于Pantoea agglomerans時，番茄紅素產量可以達到27 mg·L－1，而當crt基因來源于Pantoea ananatis時，番茄紅素的產量只有12 mg·L－1。研究表明，番茄紅素產量的差異主要是crtE基因引起的，crtE編碼的GGPP合酶可以增加FPP向GGPP的轉化，是番茄紅素合成途徑的限速酶。對比發現，Pantoea agglomerans來源的crtE基因具有更高的活性，有利于提高番茄紅素的產量。IPP和它的同分異構體DMAPP是番茄紅素合成的重要前體，idi編碼的IPP異構酶有助于維持IPP和DMAPP之間的代謝平衡，在番茄紅素合成途徑中扮演著重要角色。Albermann等［11］用來源于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的idi基因替換大腸桿菌的idi基因，可以提高重組菌產番茄紅素的能力。來源于大腸桿菌和地衣芽孢桿菌idi基因的大小分別為549 bp和1 050 bp，編碼的氨基酸序列相似度只有6%。這說明了異種同源基因在進化過程中發生歧化從而導致他們在結構和功能上某種程度的差異，選用合適來源的酶對代謝網絡的優化具有重要的意義。

2.2 代謝途徑旁路基因的敲除 通過旁路代謝途徑基因的敲除增加目的產物的代謝流量是代謝工程的常用方法之一。微生物體內代謝途徑非常復雜，除目標產物的合成途徑外，許多旁路代謝流對微生物的生長都有重要的作用。如果為了加強產物合成代謝流而任意敲除旁路代謝基因往往會影響菌體的正常生理功能導致產物產量的下降，所以找到合適的待敲除基因是整個旁路代謝網絡優化的首要任務。

Stephanopoulos課題組［12］根據重組大腸桿菌整體代謝網絡，建立了一個代謝通量計算模型，通過對全基因組范圍的代謝通量平衡分析和基因敲除模擬計算，篩選出了6個目標基因靶點(gdhA、gpmA、gpmB、aceE、fdhF和talB)。經過單基因，雙基因和三基因組合敲除實驗，發現敲除gdhA、aceE和fdhF三個基因能使番茄紅素的產量提高近40%。其中，gdhA編碼谷氨酸脫氫酶，催化α－酮戊二酸和NADPH轉化為谷氨酸，敲除gdhA可以增加前體NADPH的供應量。aceE編碼丙酮酸脫氫酶，敲除aceE能阻止丙酮酸流向乙酰輔酶A的合成，從而增加前體物質丙酮酸的量。fdhF編碼甲醛脫氫酶，催化甲醛轉化為CO2和H2O，敲除fdhF可減少丙酮酸流向甲醛及其他副產物，結果同樣是增加丙酮酸的量而促進番茄紅素的合成。翁志明等［13］選擇BW25113作為基因敲除的起始菌，利用Red重組技術分別對gdhA、fdhF和aceE這三個基因進行敲除，結果表明基因型為 ΔgdhAΔaceE和ΔgdhAΔfdhFΔaceE的兩種菌株合成番茄紅素的能力最強，番茄紅素產量分別為3.8 mg·g DCW－1和3.6 mg·gDCW－1。ackA－pta可以催化乙酰輔酶A轉化為乙酸，Vadali等［14］發現敲除ackA－pta基因可以將番茄紅素產量提高約45%。ackA－pta基因的敲除一方面可以降低乙酰輔酶A的消耗，從而減弱了丙酮酸流向乙酰輔酶A的代謝流;另一方面還可以降低乙酸的積累可以減弱其對菌體生長的不利影響。在此基礎上通過鏈霉菌甲羥戊酸途徑的引入，提高了番茄紅素前體IPP的含量，進一步將番茄紅素的產量提高了1倍。

2.3 代謝途徑關鍵基因的過量表達 番茄紅素代謝途徑中一些前體物質的積累有利于番茄紅素的合成，這些物質可以通過相關酶的過量表達來增加其含量，以滿足番茄紅素高效合成的需求。idi基因編碼代謝途徑中的IPP異構化酶，能夠促進IPP向DMAPP的轉化，從而調節這兩個代謝中間產物的平衡。而ispA是中間產物FPP合成酶基因，idi或ispA的過量表達或兩者同時過量表達均可使番茄紅素產量得到提高，其中同時過量表達idi和ispA時番茄紅素產量比原始菌提高了69%［15］。Kang等［16］利用鳥槍法分析大腸桿菌基因組發現過量表達dxs、crl、rpoS和appY均可以促進重組大腸桿菌番茄紅素的合成。其中dxs是MEP途徑的關鍵酶基因，其過量表達使得流向IPP的代謝流增強，直接提高關鍵前體IPP的量;crl編碼細胞表面纖維蛋白，增大外膜空間有利于番茄紅素的儲存;rpoS編碼σs因子，σs因子為RNA聚合酶的亞基，起到調節基因轉錄的作用;appY編碼能量代謝調控蛋白。研究發現，過量表達dxs或appY時番茄紅素產量可達到2.8 mg·gDCW－1，而當dxs分別同其他三個基因一起過量表達時，均比單獨過量表達 dxs效果好。此外，Jin和Stephanopoulos［17］通過基因組合分析又發現過量表達yjiD、ycgW、yhbL、purDH和yggT也可以提高番茄紅素的產量。研究將旁路基因的敲除和限速基因的過量表達結合運用，篩選到一株基因型為WS140(T5p－dxs，T5p－idi，rrnBp－yjiD－ycgW，ΔgdhAΔaceEΔfdhF，pACLYC)的菌株，產番茄紅素的量是原始菌的4倍，達到了16 mg·gDCW－1。用生物信息學的方法線性規劃細胞生長速率和產物生成速率可顯示能增強目標產物產量的代謝流，Choi等［18］在此基礎上結合基因敲除和啟動子替換等方法構建了一株重組菌WLGB－RPP (pTrcDx－idi－mdh，pLyc184)將番茄紅素的產量提高到了283 mg·L－1。

2.4 代謝途徑多基因協同調控 微生物的代謝網絡十分復雜，目標產物的最終合成需要經過一系列的轉化，而各步反應間的代謝流存在相互影響和制約的作用，因此只對若干個基因進行操作將難以達到全面發掘與提升產物合成能力的目標。Wang等［19］以番茄紅素生物合成途徑的20種關鍵基因(dxs、dxr、ispD、ispE、ispG、ispH、idi、ispA、appY、rpoS、crl、elbA、elbB、yjiD、purH、rnlA、yggT、ycgZ、ymgA、ariR)為研究目標，建立了一種能對大量基因的轉錄水平進行同時調控的方法(MAGE)。針對這20種基因的SD序列進行研究，首先化學合成了轉錄效率不等的SD序列基因庫，通過電轉化方法將基因庫導入大腸桿菌感受態細胞，利用同源重組技術隨機替換目標SD序列，實現了對全部基因轉錄水平的整體調控。該實驗在3天之內就篩選到了一株番茄紅素產量提升5倍的突變株，分析表明由于該突變株的dxs和idi基因的轉錄水平得到了增強使得番茄紅素產量大幅提高。

2.5 通過培養條件的優化提高產量 不同的生長環境對微生物菌體的生長和代謝產物的生成都會產生影響。番茄紅素為脂溶性物質，一般都積累在細胞膜上，這在一定程度上改變了細胞表面的形狀，使細胞產生聚集現象。表面活性劑可以有效地減少表面張力，使細胞分散，從而改善菌體的生長狀況。Yoon等［20］通過在培養基中添加表面活性劑吐溫80將番茄紅素的產量提高了27%。碳源在大腸桿菌中的運輸方式主要有兩種:磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴型和非磷酸烯醇式丙酮酸依賴型。Jongrae Kim等［21］研究了三種磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴型附加碳源(葡萄糖、甘露糖和麥芽糖)和三種非磷酸烯醇式丙酮酸依賴型碳源(甘油、半乳糖和乳糖)對番茄紅素產量的影響，結果表明甘油為附加碳源時的產量最高，是葡萄糖做為附加碳源時的30倍。Yeong－Su Kim等［22］也對工程菌E.coli K12的培養基碳源進行優化，發現在含有甘油的培養基中加入10 mg·L－1葡萄糖和7.5 mg·L－1的L－阿拉伯糖發酵34 h時可使番茄紅素的產量提高到1 350 mg·L－1，比未優化培養基提高了7.1倍。除了碳源，培養溫度對番茄紅素產量也會產生影響，有報道相對低的溫度(20～30℃)培養更有利于番茄紅素的積累［14，23，24］，但是此時菌體的生長卻相對緩慢，會因為發酵時間延長而影響經濟效益。運用溫度梯度培養可以有效地解決這一矛盾，Kim等［25］將工程菌E.coli DH5α先在37℃下培養，20 h后轉移到25℃，在此期間補加甘油作為碳源和阿拉伯糖作為誘導劑，60 h后番茄紅素產量可達到260 mg· L－1，比一直在25℃條件下培養時產量提高了20%。

3 總結與展望

利用基因工程菌發酵生產番茄紅素已經成為研究的重要發展方向，通過對番茄紅素代謝網絡的全面研究，可以有效地指導生物合成途徑的遺傳修飾，從而提高番茄紅素的生產能力。但和番茄紅素合成相關的酶大多分布于脂膜上，在非膜環境下很容易失去活性，使得番茄紅素代謝網絡的酶學研究變得十分困難。不僅如此，番茄紅素的最終合成涉及一系列步驟的反應，各步反應之間相互聯系，互為影響，如何使之更好的協同作用來提高番茄紅素的合成能力也是一個亟待解決的關鍵問題。因此，對基因工程菌的基因轉錄組和蛋白質組進行分析，測定番茄紅素生產過程中多基因轉錄變化情況，研究關鍵基因群及其作用機理，在深入理解代謝網絡構成和調控機制的基礎上，通過有效協同抑制各代謝支流及增強目標代謝流，進一步提高番茄紅素產量，將成為利用微生物發酵法生產番茄紅素的新的研究方向之一。

［1］ Qu MY，Zhou Z，Chen CH，et al.Lycopene protects against trimethyltin－induced neurotoxicity in primary cultured rat hippocampal neurons by inhibiting the mitochondrial apoptotic pathway［J］.Neurochem Int，2011，59(8):1095－ 1103.

［2］ Lu R，Dan H，Wu R，et al.Lycopene:Features and potential significance in the oral cancer and precancerous lesions［J］.J Oral Pathol Med，2011，40(5):361－368.

［3］ Omoni AO，Aluko RE.The anticarcinogenic and antiatherogenic effects of lycopene:a review［J］.Trends Food Sci Tech，2005，16(8):344－350.

［4］ Hirschberg J.Carotenoid biosynthesis in flowering plants［J］.Curr Opin Plant Boil，2001，4(3):210－218.

［5］ Ronen G，Cohen M，Zamir D，et al.Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato fruit development:expression of the gene for lycopene epsilon－cyclase is downregulated during ripening and is elevated in the mutant Delta［J］.Plant J，1999，17(4):341－351.

［6］ Rohmer M.The discovery of a mevalonate－independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria，algae and higher plants［J］.Nat Prod Rep，1999，16(5):565－574.

［7］ Rohdich F，Hecht S，G?rtner K，et al.Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway:metabolic role of IspH(LytB)protein［J］.P Natl Acad Sci，2002，99(3): 1158－1163.

［8］ Cunningham FX，Gantt E.A portfolio of plasmids for identification and analysis of carotenoid pathway enzymes:A－donis aestivalis as a case study［J］.Photosynth Res，2007，92(2):245－259.

［9］ Harada H，Misawa N.Novel approaches and achievements in biosynthesis of functional isoprenoids in Escherichia coli［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，84(6):1021－1031.

［10］Yoon SH，Kim JE，Lee SH，et al.Engineering the lycopene synthetic pathway in E.coli by comparison of the carotenoid genes of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74(1):131－139.

［11］Rad SA，Zahiri HS，Noghabi KA，et al.Type 2 IDI performs better than type 1 for improving lycopene production in metabolically engineered E.coli strains［J］.World J Microbiol Biotechnol，2012，28(1):313－321.

［12］Alper H，Jin YS，Moxley JF，et al.Identifying gene targets for the metabolic engineering of lycopene biosynthesis in Escherichia coli［J］.Metab Eng，2005，7(3):155－164.

［13］Liu JZ，Weng ZM，Wang Y，et al.Metabolic engineering based on systems biology for chemicals production［J］.Front Biol，2009，4(3):260－265.

［14］Vadali RV，Fu Y，Bennett GN，et al.Enhanced lycopene productivity by manipulation of carbon flow to isopentenyl diphosphate in Escherichia coli［J］.Biotechnol Prog，2005，21(5):1558－1561.

［15］盧韋.大腸桿菌基因工程菌生產番茄紅素研究［D］.北京:首都師范大學，2007:47－52.

［16］Kang MJ，Lee YM，Yoon SH，et al.Identification of genes affecting lycopene accumulation in Escherichia coli using a shot－gun method［J］.Biotechnol Bioeng，2005，91(5): 636－642.

［17］Jin YS，Stephanopoulos G.Multi－dimensional gene target search for improving lycopene biosynthesis in Escherichia coli［J］.Metab Eng，2007，9(4):337－347.

［18］Choi HS，Lee SY，Kim TY，et al.In silico identification of gene amplification targets for improvement of lycopeneProduction［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76(10):3097－3105.

［19］Wang HH，Isaacs FJ，Carr PA，et al.Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution［J］.Nat Lett，2009，460(7257):894－898.

［20］Yoon SH，Lee YM，Kim JE，et al.Enhanced lycopene production in Escherichia coli engineered to synthesize isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate from mevalonate［J］.Biotechnol Bioeng，2006，94(6):1025－1032.

［21］Kim J，Kong MK，Lee SY，et al.Carbon sources－dependent carotenoid production in metabolically engineered Escherichia coli［J］.World J Microbiol Biotechnol，2010，26(12):2231－2239.

［22］Kim YS，Lee JH，Kim NH，et al.Increase of lycopene production by supplementing auxiliary carbon sources in metabolically engineered Escherichia coli［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，90(2):489－497.

［23］Lee PC，Mijts BN，Schmidt－Dannert C.Investigation of factors influencing production of the monocyclic carotenoid torulene in metabolically engineered Escherichia coli［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，65(5):538－546.

［24］Kim SW，Kim JB，Jung WH，et al.Over－production of beta－carotene from metabolically engineered Escherichia coli［J］.Biotechnol Lett，2006，28(12):897－904.

［25］Kim SW，Kim JB，Ryu JM，et al.High－level production of lycopene in metabolically engineered E.coli［J］.Process Biochem，2009，44(8):899－905.