激活素A和卵泡抑素對大鼠心肌成纖維細胞增殖及膠原沉積的影響

魏 群 李煥明 劉 勇 顧乃剛 張 寰 (天津醫科大學第四中心臨床學院，天津 300140)

激活素A和卵泡抑素對大鼠心肌成纖維細胞增殖及膠原沉積的影響

魏 群 李煥明 劉 勇 顧乃剛 張 寰 (天津醫科大學第四中心臨床學院，天津 300140)

目的探討激活素A(Activin A)和卵泡抑素(FS)對體外培養的原代大鼠心肌成纖維細胞增殖及膠原沉積的影響。方法取出生24 h內Wistar乳鼠心肌成纖維細胞進行體外培養，分別向培養液中加入Activin A或FS+Activin A。應用MTT法檢測細胞增殖情況，應用化學比色法檢測培養液上清羥脯氨酸含量，RT-PCR法檢測培養細胞Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)和Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)mRNA表達。結果與對照組相比，不同濃度Activin A組心肌成纖維細胞的OD值及羥脯氨酸含量明顯增高(P＜0.05～0.01)，Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA表達水平明顯升高。不同濃度FS組可降低心肌成纖維細胞的OD值及羥脯氨酸含量(P＜0.05～0.01)，下調Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA表達水平。結論Activin A能夠促進心肌成纖維細胞增殖及膠原沉積，提示Activin A可能在心肌間質纖維化的發生發展中起重要作用，FS能夠拮抗Activin A誘導的心肌間質纖維化。

激活素A;卵泡抑素;心肌成纖維細胞;心肌間質纖維化

激活素A(Activin A)屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員之一，與急性期應答以及纖維化形成有關〔1〕。一定程度的Activin A表達有助于損傷修復過程正常進行，但其過度表達則可能與器官纖維化及某些慢性纖維化疾病的形成有關。卵泡抑素(FS)作為激活素特異結合蛋白，與Activin A有高度的親和力，可以阻斷激活素的生物學作用。Activin A與FS形成Activin A-FS系統共同參與調節成纖維細胞。本實驗通過觀察Activin A對體外培養原代大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原沉積的影響，探討Activin A和FS在心肌間質纖維化中的作用，闡明心肌間質纖維化的可能發病機制，為防治心肌纖維化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 出生24 h內的Wistar乳鼠，購自天津醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養基(DF，Hyclone公司)，重組人Activin A、FS(美國Peprotech公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、鏈霉素(華北制藥廠)，四甲基耦氮唑鹽(MTT，Amersha公司)，Trizol RNA提取液、RT-PCR試劑盒(Takara公司)，羥脯氨酸測定試劑盒由南京建成提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取出生24 h內的Wistar乳鼠10只，75%酒精消毒皮膚，無菌開胸剪取心臟，將心臟放入盛有預冷D-Hank液的平皿中，剔除心耳及大血管，冷D-Hank液沖洗心室3次，將心室肌剪成1mm3大小的碎塊，加10ml0.08%胰酶，35℃ ～37℃反復消化，每次5 min，收集歷次的消化上清，加入小牛血清終止消化，離心2次，1 200 r/min，5 min，細胞沉淀用20%血清DMEM培養液混懸，37℃、5%CO2培養60 min后棄上清，瓶內貼壁細胞即為心肌成纖維細胞。后以10%血清DMEM培養液培養，待細胞80%長滿時，吸棄培養液，加入0.25%胰酶消化，血清終止，1 200 r/min，5 min離心洗去胰酶，加入培養液重懸，1∶2傳代。后應用抗波形蛋白單克隆抗體免疫細胞化學染色鑒定心肌成纖維細胞純度達98%。試驗采用2～3代的心肌成纖維細胞。

1.2.2 Activin A和FS對原代大鼠心肌成纖維細胞增殖和羥脯氨酸分泌的影響 取對數生長期細胞，調節細胞密度至1×105個/m l，接種于96孔板，0.1 ml/孔，培養24 h后更換10%血清DMEM培養24 h，隨后將細胞分為:(1)control組;(2)A組:Activin A 10 ng/ml;(3)B組:Activin A 30 ng/ml;(4)C組:Activin A 50 ng/m l;(5)D組:Activin A 100 ng/m l;(6)E組:FS 10 ng/ml+Activin A 10 ng/m l;(7)F組:FS 30 ng/m l+Activin A 30 ng/m l;(8)G組:FS 50 ng/ml+Activin A 50 ng/ml;(9)H組:FS 100 ng/m l+Activin A 100 ng/ml。每組6復孔，各組細胞加藥后繼續培養24 h，用藥后第24小時各孔吸取培養液，用于測定羥脯氨酸含量，后加入15μl5 mg/mlMTT，4 h后各孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻 10 min，酶標儀570 nm處測定吸光度。

1.2.3 RT-PCR法檢測心肌成纖維細胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA表達 細胞培養及分組同上，加入藥品后再繼續培養24 h。實驗結束后應用TRIzol試劑盒抽提細胞總RNA，取總RNA 1μg行逆轉錄后取5μl進行PCR擴增。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參照，對 Col-Ⅰ 及Col-Ⅲ mRNA表達進行半定量檢測。引物序列由上海生物工程技術有限公司合成。β-actin正義引物序列:5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'，反義引物序列:5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'，片段長度359 bp;Col-Ⅰ正義引物序列:5'-AGGGTCATCGTGGCTTCTC-3'，反義引物序列:5'-ACCTTCGCTTCCATACTCG-3'，片段長度361 bp;Col-Ⅲ正義引物序列:5'-CTCAAGAGCGGAGAATACTGG-3'，反義引物序 列:5'-TGCCACCATCATAGACTAGATTC-3'，片 段 長 度704 bp。PCR反應:取3μl逆轉錄產物分別進行PCR擴增。PCR 反應條件:95℃預變性90 s，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，循環32次，最后72℃延伸10 min。取5μl PCR反應產物進行1.5%瓊脂糖電泳，光密度掃描后圖片經Image J軟件分析，結果以檢測蛋白/β-actin的光密度比值表示。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，實驗數據以±s表示，采用方差分析進行檢驗。

2 結果

2.1 Activin A對原代大鼠心肌成纖維細胞增殖的影響 與Control組相比，Activin A對心肌成纖維細胞增殖有明顯的促進作用，在50 ng/m l以內呈劑量依賴性。當其濃度達100 ng/ml時，仍有促進心肌成纖維細胞增殖的作用，高于對照組(P＜0.01)，但增殖效應減弱。FS能拮抗Activin A對心肌成纖維細胞增殖的促進作用，呈劑量依賴性(P＜0.05～0.01)。見表1。

2.2 Activin A促進原代大鼠心肌成纖維細胞羥脯氨酸分泌的影響 與Control組相比，不同劑量Activin A組的羥脯氨酸含量明顯增加(P＜0.05～0.01)，表明給予Activin A后可引起心肌成纖維細胞增殖并促進膠原分泌;與不同劑量Activin A組相比，FS 10、30、50、100 ng/ml能降低心肌成纖維細胞羥脯氨酸含量(P＜0.05～0.01)。見表1。

表1 Activin A及FS對心肌成纖維細胞增殖及羥脯氨酸分泌的影響(±s，n=6)

表1 Activin A及FS對心肌成纖維細胞增殖及羥脯氨酸分泌的影響(±s，n=6)

與control組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與A組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 OD值 培養液上清羥脯氨酸含量(μg/ml)control組0.088±0.012 4.01±0.13 A組 0.143±0.0112) 6.47±0.151)B組 0.165±0.0102) 7.98±0.162)C組 0.186±0.0112) 8.91±0.122)D組 0.190±0.0152) 9.16±0.152)E組 0.134±0.0143) 5.98±0.143)F組 0.121±0.0174) 5.45±0.174)G組 0.098±0.0104) 4.86±0.104)H組 0.097±0.0114) 5.14±0.114)

圖1 各組心肌細胞Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA的表達

2.3 Activin A對心肌成纖維細胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA表達水平的影響 如圖1所示，與control組相比，不同劑量Activin A組心肌成纖維細胞Col-Ⅰ及Col-Ⅲ mRNA表達水平明顯增高，以Activin A 50 ng/ml劑量最顯著。與不同劑量Activin A組相比，FS 10、30、50、100 ng/ml能下調心肌成纖維細胞 Col-Ⅰ及Col-Ⅲ mRNA表達。

3 討論

心室重構是慢性心力衰竭發生發展的主要病理基礎。在分子水平上，心室重構既包括心肌細胞的重構，又包括心肌間質的膠原沉積和纖維化〔2〕。其中膠原合成與表達(包括Ⅰ、Ⅲ型膠原)的增多及在心肌間質內聚集是心肌纖維化的重要表現〔3〕。已發現許多細胞因子參與心肌纖維化的發病機制，其中以血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及TGF-β1的作用最強。Activin A屬于TGF-β超家族成員，研究表明一定程度的Activin A表達有助于損傷修復過程正常進行，但其過度表達則可能與器官纖維化及某些慢性纖維化疾病的形成有關。Yndestad等〔4〕研究顯示心梗后心衰模型左室缺血區及非缺血區Activin A表達水平明顯增高，可以誘導與心肌重塑相關的介質如心鈉素(ANP)、腦鈉素(BNP)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9等mRNA表達增加，而且上述因子在間質纖維化的發展過程中起重要作用。新近實驗證明在心肌缺血/再灌注損傷中心肌組織Activin A表達亦增強〔5〕。這些均提示Activin A在細胞增殖分化、纖維化及損傷修復過程中都具有重要作用，對細胞外基質的合成具有促進作用。FS是Activin A的天然結合蛋白，具有廣泛的組織分布，與Activin A有很高的親和力，而且FS與Activin A之間的結合幾乎是不可逆的，從而阻斷Activin A的生物活性〔6〕。

本實驗向體外培養的大鼠心肌成纖維細胞培養液中加入外源性的Activin A，結果發現Activin A在10～50 ng/ml范圍內呈劑量依賴性地刺激心肌成纖維細胞增殖;當Activin A濃度達100 ng/m l時，仍具有刺激成纖維細胞增殖的作用，但作用已減弱，說明在一定的濃度范圍內Activin A對心肌成纖維細胞具有刺激增殖作用。另外，本實驗還發現在RNA水平，Activin A能夠促進心肌成纖維細胞Col-Ⅰ及Col-Ⅲ mRNA表達及羥脯氨酸分泌。說明Activin A能夠促進心肌間質膠原沉積，與心肌間質纖維化密切相連，這為闡明心衰的發病機制提供了新的方向。FS能夠抑制Activin A誘導的心肌成纖維細胞的增殖、羥脯氨酸的分泌，下調Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA水平表達。

總之，Activin A可能通過促進心肌成纖維細胞Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA表達及羥脯氨酸分泌，參與了心肌纖維化進程。Activin A可能是導致心肌間質纖維化的又一重要細胞因子，是改善心衰的新的治療靶點。而FS通過與Activin A不可逆結合，抑制了Activin A的作用，FS在未來有可能成為改善心衰的新的藥物。

1 Werner S，Alzheimer C.Roles of activin in tissue repair，fibrosis，and inflammatory disease〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2006;17(3):157-71.

2 Zile MR，Brutsaert DL.New concepts in diastolic dysfunction and dias-tolic heart failure:PartⅡ:.causalmechanisms and treatment〔J〕.Circulation，2002;105(2):1503-8.

3 Yang F，Yang XP，Liu YH，et al.Ac-SDKP reverses inflammation and fibrosis in ratswith heart failure aftermyocardial infarction〔J〕.Hypertension，2004;43(2):229-36.

4 Yndestad A，Ueland T，?ie E，et al.Elevated levels of activin a in heart failure:potential role in myocardial remodeling〔J〕.Circulation，2004;109(11):1379-85.

5 Zhang LJ，Huang H，Pan PX，et al.Study on the expression of Activin-A in myocardial ischemia postconditioning〔J〕.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2009;40(1):97-9.

6 Shimonaka M，Inouye S，Shimasaki S，et al.Follistatin binds to both activin and inhibin through the common subunit〔J〕.Endocrinology，1991;128(6):3313-5.

R542.2+3

A

1005-9202(2012)16-3475-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.059

天津市衛生局面上基金資助項目(No.2011KY05)

張 寰(1961-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事冠心病介入治療。

魏 群(1970-)，女，博士，主治醫師，主要從事心力衰竭的發病機制及治療的相關研究。

〔2012-01-20收稿 2012-04-10修回〕

(編輯 袁左鳴)