應用ELISA方法檢測老年動脈粥樣硬化患者血清抗負電性低密度脂蛋白自身抗體含量

程金華 (齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

應用ELISA方法檢測老年動脈粥樣硬化患者血清抗負電性低密度脂蛋白自身抗體含量

程金華 (齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 建立一種通過酶聯免疫吸附法(ELISA)定量測定動脈粥樣硬化患者血清中抗負電性低密度脂蛋白〔LDL(－)〕自身抗體含量的方法。方法 從老年動脈粥樣硬化患者血清中純化得到LDL(－)，吸附到96孔板用于特異性捕獲抗LDL(－)自身抗體。對酶聯免疫吸附的最低檢測限(LOD)、定量限(LOQ)、批內和批間的精密度以及準確度、回收率進行評價。結果 抗LDL(－)-ELISA分析法線性回歸方程為y=1.250 4x+3.292 6(R2=0.994)，線性范圍在為0.004～0.125 mU/L。批內和批間的精密度和準確度、回收率均符合免疫分析要求。結論 本文建立的ELISA方法可用于老年動脈粥樣硬化患者血清內抗LDL(－)自身抗體的定量分析、臨床研究和生化調查。

抗負電性LDL(－)自身抗體;ELISA;評價;動脈粥樣硬化

多種抗原刺激物與動脈粥樣硬化的發病相關，這些刺激大多來自修飾后的自身抗原負電性低密度脂蛋白〔LDL(－)〕是存在于血清中的修飾度較小的一類LDL，具有致炎和致動脈粥樣硬化作用。LDL(－)具有免疫原性，并且人血清中存在針對LDL(－)表位的自身抗體〔1〕。LDL(－)通過炎癥和免疫機制，使機體生產的抗LDL(－)自身抗體導致動脈粥樣硬化的發生〔2〕。本文擬建立一種通過酶聯免疫吸附法(ELISA)定量測定老年動脈粥樣硬化患者血清中游離抗LDL(－)自身抗體含量的方法。

1 材料與方法

1.1 分離LDL(－) 按照參考文獻〔3〕方法分離從35名60～80歲老年動脈粥樣硬化患者體內獲得的血清樣本，得到純化的LDL(－)，通過5%瓊脂糖電泳檢測，上樣使用10μg LDL(－)和天然LDL，60 V穩壓電泳2 h，用0.5%考馬斯亮藍G快速測定試劑盒顯色比較。

1.2 ELISA分析方法建立

1.2.1 方法步驟 在50μl 0.05 mol/L碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中溶解LDL(－)配制成1μg/ml溶液，均勻涂布在96孔板(COSTAR，紐約，康寧)底部，4℃保存過夜。然后用含0.05%吐溫 20的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)洗滌 3次(200μl/孔)。用含2%脫脂奶粉(預先加熱到100℃)和0.01%的吐溫20的PBS緩沖溶液封閉(150μl/孔)，37℃孵育90min。用上述的緩沖溶液再洗滌3次(200μl/孔)。將標準或樣本血清用含有1%脫脂奶粉和0.01%吐溫20的PBS按照1∶400稀釋，加入到96孔板中(50μl/孔)，37℃孵育90 min。用抗人-IgG結合辣根過氧化物酶(Bio-Rad公司，按1∶2 500稀釋)的抗體37℃孵育1 h。過氧化物酶的活性用50μl TMB(Sigma公司)檢測，37℃孵育10 min。加入0.5 mol/L的硫酸停止反應，用酶標儀(北京普朗公司)測量450 nm處吸光值(A450)。

1.2.2 繪制標準曲線 分別用6個濃度的標準單克隆抗體(0.001，0.008，0.016，0.031，0.063，0.125 mU/L)作為標準液，一式三份，用1.2.1的方法檢測A450值，繪制工作標準曲線，帶入下列公式:y=a×x+b，其中y是在450 nm處的吸光度，x為log10 LDL(－)濃度，a和b分別為校準斜率和截距。

1.2.3 最低檢測限和最低定量限(LOD，LOQ) 將標準樣品三倍稀釋直到抗體濃度為0.000 2 mU/L，用1.2.1的方法測A450值，用10個樣品的平均吸光值和3倍標準偏差表示LOD:LOD=M10B+3SDB，用10個樣品的平均吸光值和10倍標準偏差表示LOQ:LOQ=M10B+10SDB。

1.2.4 精密度和準確度 將含抗LDL(－)自身抗體的血清樣品稀釋成3不同濃度，使其濃度在整個標準曲線范圍內(最低定量限附近1個，中心附近1個，標準曲線上邊界附近1個)。批內精密度通過對每個濃度樣品重復測定10次進行比較。批間精密度通過對上述濃度樣品分5 d各重復測定結果進行比較，結果用變異系數(CV%)表示。LOQ附近濃度樣品的批內和批間精密度CV%應小于20%，其他濃度應小于15%。準確度通過測定含內標的抗LDL(－)自身抗體的回收率(R%)表示。回收率應在額定濃度80%～120%范圍內。

1.2.5 干擾物質 將血清樣品分別加入含有不同濃度的潛在干擾劑，如脂類(甘油三酯等)、總膽紅素和血紅蛋白。分別測定加入上述干擾劑前后的A450值，前后數值大于20%變化的視為干擾物質。

1.3 統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件進行分析。

2 結果

得到的純化物用瓊脂糖電泳分析結果，LDL(－)遷移率較天然LDL大。抗LDL(－)自身抗體濃度線性回歸方程為y=1.250 4x+3.292 6(R2=0.994)，線性范圍為 0.004～0.125 mU/L。血清按1∶100，1∶200，1∶400 和 1∶800 稀釋均得到較好的線性。見圖 1。經統計學處理，LOD、LOQ分別為0.002 8 mU/L和0.003 2 mU/L，準確度用回收率法表示，回收率為96.7%到112.9%。低濃度(0.006 mU/L)批內、批間、可接受CV分別為6.3%、17.1%、20.0%，中濃度(0.061 mU/L)分別為8.4%、10.1%、15.0%，高濃度(0.110 mU/L)分別為7.2%、11.3%、15.0%。抗LDL(－)自身抗體加入量為0.008、0.012、0.024、0.030 nU/L 時回收率(R%)分別為 98.5 ±6.5，96.7±2.2，112.9±1.2，104.3±2.1。干擾物質實驗結果顯示，抗LDL(－)自身抗體的ELISA分析沒有顯著干擾物質，添加的脂類物質高達800 mg/dl(以甘油三酯計)、總膽紅素高達20 mg/dl和血紅蛋白高達250 mg/dl，對結果產生的變化量分別是8.6%、1.2%和11.2%，小于規定的20%。

圖1 抗LDL(－)自身抗體ELISA法標準曲線

3 討論

免疫分析檢測法在對疾病常規診斷和監測上發揮重要作用，本研究的目的是發展一種快速、高效、準確的ELISA法分析老年動脈粥樣硬化患者血清中的抗LDL(－)自身抗體的濃度。本法利用老年動脈粥樣硬化患者體內提取的血清中分離出而非體外修飾的LDL(－)作為抗原，因此純化抗原是關鍵的一步。如果抗原在凈化過程中存在污染物，在后面的酶聯免疫吸附過程中可能會發生交叉反應，這可能喪失特異性。本文中抗LDL(－)-ELISA法使用通過色譜純化的LDL(－)，從而保證了檢測質量。體外修飾的LDL與體內修飾的LDL的表位抗原有多大程度相同尚不清楚。本研究的最大優點是開發了一種特異性檢測針對內源性修飾抗LDL(－)自身抗體的酶聯免疫吸附分析法。經過方法驗證，該方法批內和批間的精密度和回收率符合免疫分析的要求〔5〕，樣品血清中存在的血脂、總膽紅素和血紅蛋白對檢測沒有嚴重影響。另外將血清儲存在－20℃ ～80℃長達6個月對檢測結果無顯著影響，但應減少樣本的反復凍融。

1 Pedrosa AM，Faine LA，Grosso DM，et al.Electronegative LDL induction of apoptosis in macrophages:involvement of Nrf2〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1801(4):430-7.

2 Siqueira AA，Osiro K，Hirai AT，etal.Antibodies against charged subfractions of LDLs are associated with disturbed ankle-brachial index and cardiovascular risk factors in a Japanese-Brazili an population with high prevalence of dislipidemias〔J〕.Int JAtheroscler，2007;2(1):68-74.

3 Santo-Faulin-Tdo E，Sena KC，Rodrigues-Telles AE，et al.Validation of a novel ELISA formeasurement of electronegative LDL〔J〕.Clin Chem Lab Med，2008;46(12):1769-75.

4 Findlay JW，Smith WC，Lee JW，et al.Validation of immunoassays for bioanalysis:a pharmaceutical industry perspective〔J〕.JPharm Biomed Anal，2000;21(6):1249-73.

R587

A

1005-9202(2012)16-3444-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.042

程金華(1969-)，女，主管技師，主要從事醫學檢驗免疫研究。

〔2012-05-17收稿 2012-06-10修回〕

(編輯 袁左鳴)